实时荧光PCR特异性检测甘草的引物及检测方法技术

本发明专利技术公开一种特异性好、灵敏度高的实时荧光PCR特异性检测甘草的引物，所述引物的DNA序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。检测的反应体系为：2X浓度的SYBR

【技术实现步骤摘要】
实时荧光PCR特异性检测甘草的引物及检测方法
本专利技术属于生物
，特别涉及一种特异性好、灵敏度高的实时荧光PCR特异性检测甘草的引物及检测方法。
技术介绍
中药鉴定的主要内容为中药材及其基元的鉴定，也包括饮片、提取物和中成药的中药成分鉴定，中药的准确鉴定是中药事业运行和发展的基本环节。以往对于中药的检测是根据形态和显微镜下特征进行分类与鉴定，鉴定周期长、时效性差。随着各种先进仪器以及分子生物学的发展，新的鉴别方法亦纷纷推出，如光谱鉴别、色谱鉴别、实时荧光PCR及DNA分子标记鉴别和蛋白质检测等等。实时荧光PCR检测是将传统PCR检测模式中的PCR扩增和检测相结合（即在同一个密闭容器中将PCR扩增反应与荧光染料检测结合在一起），即在每一个PCR循环后检测扩增产物，当PCR扩增反应结束后，可以得到每个样品的PCR扩增产物变化曲线。通过分析这些反应曲线，可以得出待测物的定性、定量检测结果，不仅具有普通PCR的高灵敏性，还具有高特异性和高精确性。然而，对于实时荧光PCR检测其PCR扩增引物及具体检测方法尤为重要，不同的引物及检测方法所得到的检测结果截然不同。迄今为止，还没有关于特异性好、灵敏度高的实时荧光PCR特异性检测甘草的引物及检测方法的相关报道。
技术实现思路
本专利技术是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种特异性好、灵敏度高的实时荧光PCR特异性检测甘草的引物及检测方法。本专利技术的技术解决方案是：一种实时荧光PCR特异性检测甘草的引物，其特征在于所述引物的DNA序列如下：上游引物：5’-AAATGCGATACTTGGTGTGAATTG-3’；下游引物：5’-AATTGGCATCGGGCAACGG-3’。一种上述实时荧光PCR特异性检测甘草的引物的检测方法，其特征在于：反应体系为：2X浓度的SYBR®PremixExTaq12.5μL浓度为10μmol/L的上游引物0.25μL浓度为10μmol/L的下游引物0.25μL浓度<50ng的待检样品的DNA模板1μL双蒸水11μL；反应参数为：变性，95℃，30s；扩增，95℃，5s、60℃，30s；循环次数30；30个循环以下产生特异性扩增曲线即为甘草。本专利技术PCR引物设计合理，用于实时荧光PCR检测，可以检测出来自甘草的微量DNA，完全将甘草与其它中药材的ITS2基因进行区分，检测特异性好、灵敏度高，方法快速，易操作。附图说明图1为本专利技术实施例的引物PCR扩增电泳检测结果图。图2为本专利技术实施例实时荧光PCR特异性检测结果图。图3为本专利技术实施例实时荧光PCR的溶解曲线检测结果图。图4为本专利技术实施例实时荧光PCR特异性检测甘草与其它中草药的结果图。图5为本专利技术实施例灵敏度分析结果图。具体实施方式一.实时荧光PCR特异性检测甘草引物序列的设计1.甘草相近物种ITS2序列分析登录NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/），以Glycyrrhizauralensis及ITS2为关键词在nr数据库中进行搜索，将搜索结果的序列下载存盘后，进行BlastN程序在nr数据库中进行相似性序列的搜索，并将所有相似性序列下载存盘。2.甘草物种特异性检测引物的设计将下载的序列进行序列的相似性分析和序列性分析，在序列的差异处设计特异性引物：上游引物：5’-AAATGCGATACTTGGTGTGAATTG-3’；下游引物：5’-AATTGGCATCGGGCAACGG-3’；二.甘草ITS2序列的克隆及测序验证1.甘草物种特异性检测引物合成在上海生工生物工程有限公司合成甘草物种特异性检测引物1对，其DNA序列为：上游引物：5’-AAATGCGATACTTGGTGTGAATTG-3’；下游引物：5’-AATTGGCATCGGGCAACGG-3’；2.甘草DNA的提取采用DNA提取试剂盒（购于宝生物公司）提取甘草（产地为吉林）模板DNA，用微量分光光度计检测提取甘草模板DNA的浓度为100ng左右；琼脂糖凝胶电泳检测：以合成的特异性引物PCR扩增甘草模板DNA的后，以2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如图1所示。图1中：M.DL2000marker；1~5.引物扩增结果；6.水对照。表明经琼脂糖凝胶电泳检测后，分别产生129bp的特异性电泳条带，电泳效果最好，PCR扩增效率高。片段的切胶回收：采用宝生物公司的DNA片段回收试剂盒将目的条带回收及纯化，操作过程按试剂盒附带的说明书进行。回收片段的连接、克隆及测序：回收片段与克隆载体pMD-19T连接，转化，经菌液PCR检测，阳性菌株送上海生物工程有限公司进行序列测定，测序结果采用NCBI的BlastN程序通过序列比对。比对结果确定所克隆的目的片段的序列为甘草ITS2序列。三.实时荧光PCR特异性检测甘草的方法25μL反应体系为：2X浓度的SYBR®PremixExTaq12.5μL浓度为10μmol/L的上游引物（SEQIDNO.1）0.25μL浓度为10μmol/L的下游引物（SEQIDNO.2）0.25μL浓度<50ng的待检样品的DNA模板1μL双蒸水11μL反应参数为：变性，95℃，30s；扩增，95℃，5s、60℃，30s；循环次数30；30个循环以下产生特异性扩增曲线即为甘草。本专利技术实施例与水对照、空白对照的特异性扩增曲线检测结果如图2所示。图2中：1.甘草、2.水对照、3.空白对照。将本专利技术实施例与水对照、空白对照的溶解曲线检测结果如图3所示。图3中：1.甘草、2.水对照、3.空白对照。结果证明了本专利技术所设计引物进行PCR扩增具有有效性及特异性。四.本专利技术实施例检测方法的特异性检测：采用DNA提取试剂盒提取下表所示各待测样品的模板DNA，用微量分光光度计分别检测所提取的模板DNA的浓度为50ng，除模板DNA外，其它按照本专利技术实施例所述实时荧光PCR特异性检测甘草的方法实时荧光PCR特异性检测栀子等其它中药材，结果如图4所示。图4中图中：1、2、3分别代表ZY1、ZY2、ZY3，4代表ZY4-ZY30的扩增曲线，5为及水对照，6为空白对照。。结果表明：产生的30个循环以下的特异性扩增曲线即为甘草，其他样品在30个循环以后出现扩增曲线或没有扩增曲线，说明本专利技术的检测方法可以准确的对甘草的成分进行鉴定，具有很好的特异性。五.本专利技术实施例检测方法的灵敏度检测采用DNA提取试剂盒提取甘草样品（产地为吉林）的模板DNA，用微量分光光度计分别检测所提取的模板DNA梯度稀释，制备成25ng/μL、5ng/μL、1ng/μL、0.2ng/μL、0.04ng/μL5个浓度梯度样品，分别按照上述反应体系及反应参数进行实时荧光PCR扩增，以确定本标准方法的检测灵敏度，结果如图5所示。图5中：1、25ng/μL扩增结果；2、5ng/μL扩增结果；3、1ng/μL扩增结果；4、0.2ng/μL扩增结果；5、0.04ng/μL扩增结果；6、空白对照。结果表明：所产生特异性扩增曲线即为甘草，当DNA浓度≥0.04ng/μL时均可以特异扩增，即该标准方法的检测灵敏度为0.04ng/μL。说明本专利技术实施例检测方法可以准确的对甘草的成分进行鉴定，具有很好的灵敏度。序列表<110>辽宁师范大学<本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种实时荧光PCR特异性检测甘草的引物，其特征在于：所述引物的DNA序列如下：上游引物：5’‑ AAATGCGATACTTGGTGTGAATTG ‑3’；下游引物：5’‑ AATTGGCATCGGGCAACGG ‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种实时荧光PCR特异性检测甘草的引物，其特征在于：所述引物的DNA序列如下：上游引物：5’-AAATGCGATACTTGGTGTGAATTG-3’；下游引物：5’-AATTGGCATCGGGCAACGG-3’。2.一种用权利要求1所述实时荧光PCR特异性检测甘草的引物的检测方法，其特征在于：反应体系为：2X浓度的...

【专利技术属性】
技术研发人员：佟少明，李洪艳，宫正，谢鲲鹏，
申请(专利权)人：辽宁师范大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21