基于特异序列的沙门菌检测引物、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于特异序列的沙门菌检测引物、试剂盒及检测方法，属于分子生物学技术领域。该引物针对沙门菌的一段特异序列或其同源性达99％以上的同源序列设计合成，具体如序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术中检测方法以待测样本基因组DNA或单菌落为模板，利用上述引物进行PCR扩增，扩增产物与阳性对照有相同条带的判定为疑似阳性，回收疑似阳性的扩增产物，进行测序分析，与SEQ ID NO.3所示序列相同或同源性达99％以上的判定为沙门菌阳性。该检测方法操作简单，敏感性和特异性高，与沙门菌的种属结果一致，检测费用低，具有良好的推广应用价值。

Detection primer, reagent kit and detection method for Salmonella based on specific sequence

The invention discloses a primer for detecting Salmonella based on a specific sequence, a kit and a detection method thereof, belonging to the technical field of molecular biology. The primers for a specific sequence of Salmonella or its homology of homologous sequence design and synthesis of more than 99%, as in the sequence table SEQ ID NO.1, SEQ ID shown in NO.2. The detection method for testing samples or single colony genomic DNA as template, PCR amplification using the primers, amplified products and positive control had the same bands judged as suspected positive recovery, suspected positive PCR products were sequenced, and SEQ ID, NO.3 shows the same sequence homology or judgment more than 99% positive for salmonella. The detection method is simple, sensitive and specific. It is consistent with the species of Salmonella. It has low detection cost and good popularization and application value.

【技术实现步骤摘要】
基于特异序列的沙门菌检测引物、试剂盒及检测方法
本专利技术涉及一种基于特异序列的沙门菌检测引物，同时还涉及包含该引物的试剂盒以及沙门菌检测方法，属于分子生物学

技术介绍
沙门菌(Salmonellosis)是一种人畜共患病的肠道致病菌，不仅严重危害人类健康，也给畜禽养殖业带来了巨大的经济损失。沙门菌在自然界中广泛存在，而人沙门菌病的感染源主要是受污染的动物肉类、蛋类和奶制品等。沙门菌病在全年均可发病，夏季是感染高峰。由于沙门菌的血清型多、抗原复杂，可引起人类胃肠炎、败血症伤寒、副伤寒、食物中毒等病症，是目前世界上食源性腹泻最常见的病原菌之一(朱超.沙门菌属血清型诊断[M].上海:同济大学出版社,2009:1,52)。吕素玲等研究表明在广西地区由沙门菌引起的食源性疾病数量仅次于副溶血性弧菌，位居第2位(吕素玲,韦程媛,李秀桂.2011年广西沙门菌血清型分布及耐药分析.中国卫生检验,2014,24:127-132)。因此，快速鉴定和追溯感染源防治沙门菌病的首要任务。目前，沙门菌的检测方法主要有常规检测法和分子生物学检测法，常规检测法又包括形态学鉴定和生化试验鉴定，其中形态学鉴定辅以生化试验在细菌鉴定中具有重要意义，但是该方法也存在一些缺点，比如重现率低，辨识能力低，相似的表型特征无法等同于相似或者关系密切的基因型等。所以对于那些通过表型特征难以区别的菌种，常规的检测方法就不能准确鉴定到种，并且该方法操作繁琐，实验周期长(邓梅葵,孙迎,韩雯晴.细菌鉴定方法[J].生物医学工程学进展,2014(02):84-88)。分子生物学检测法包括DNA(G+C)mol％、核酸杂交、16SrRNA序列分析、MLST(多位点序列分型，MultiLocusSequenceTyping)、全基因组测序以及核酸指纹图谱等(-SánchezB,Priego-CapoteF,deCastroML.MetabolomicsanalysisI.Selectionofbiologicalsamplesandpracticalaspectsprecedingsamplepreparation[J].TrACTrendsinAnalyticalChemistry,2010,29(2):111-119.)，具有快速、简便等特点，且能从本质上阐明细菌间的亲缘关系。如公布号CN105936935A的专利技术专利公开的一种快速鉴定特定血清型沙门菌的方法，包括：以样品基因组DNA为模板，利用引物SEQIDNO.1、SEQIDNO.2进行PCR扩增，凝胶电泳检测有目的条带且测序结果与tcpS基因核苷酸相似性达100％的确定为肠炎沙门菌、鸡白痢/伤寒沙门菌或都柏林沙门菌。但是，该方法仅是针对3种具体血清型的沙门菌进行检测，没有涵盖多种血清型的沙门菌。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于特异序列的沙门菌检测引物。同时，本专利技术还提供一种包含上述引物的检测试剂盒。最后，本专利技术再提供一种基于特异序列的沙门菌检测方法。为了实现以上目的，本专利技术所采用的技术方案是：沙门菌检测引物，根据特异序列或者与该序列同源性达99％以上的同源序列设计合成，特异序列如SEQIDNO.3所示，同源序列如SEQIDNO.4所示。引物设计遵循本领域通用准则，采用常规引物设计软件完成。具体的，沙门菌检测引物如下所示：上游引物：5'-AAAGGAACGGGTTGCTGTAA-3'；下游引物：5'-TATCAGGACGTTTTTTCCGC-3'。基于特异序列的沙门菌检测试剂盒，包含以下引物：上游引物：5'-AAAGGAACGGGTTGCTGTAA-3'；下游引物：5'-TATCAGGACGTTTTTTCCGC-3'。所述试剂盒还可以包括：2×TaqPCRMasterMix(0.1U/μLTaqDNAPolymerase，2×PCR反应缓冲液，0.4mMdNTP，4mMMgSO4)、灭菌超纯水、阳性对照(沙门菌基因组DNA或甘油保存菌液)、10×PCR菌落增强剂以及DNAMarkerDL2000等。基于特异序列的沙门菌检测方法，包括以下步骤：1)以待测样本基因组DNA或单菌落为模板，利用引物进行PCR扩增，扩增产物经电泳分析与阳性对照有相同条带的判定为疑似阳性；2)回收疑似阳性的扩增产物，进行测序分析，与SEQIDNO.3(287bp)所示序列相同或同源性达99％以上的判定为细菌阳性；步骤1)中引物如下所示：上游引物：5'-AAAGGAACGGGTTGCTGTAA-3'；下游引物：5'-TATCAGGACGTTTTTTCCGC-3'。步骤1)中待测样本基因组DNA可采用煮沸法或DNA提取试剂盒提取。步骤1)中PCR扩增的反应体系为：2×TaqPCRMasterMix(0.1U/μLTaqDNAPolymerase，2×PCR反应缓冲液，0.4mMdNTP，4mMMgSO4)12.5μL，8μmol/L上、下游引物各1μL，10～20ng/μL待测样本基因组DNA2μL，灭菌超纯水8.5μL，总计25μL。或者，PCR扩增的反应体系为：2×TaqPCRMasterMix(0.1U/μLTaqDNAPolymerase，2×PCR反应缓冲液，0.4mMdNTP，4mMMgSO4)12.5μL，8μmol/L上、下游引物各1μL，单菌落，1×PCR菌落增强剂2.5μL，灭菌超纯水补足至25μL。步骤1)中PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共32个循环；72℃继续延伸10min。步骤1)中阳性对照为沙门菌。本专利技术的有益效果：本专利技术通过对CRISPRdatabase数据库中沙门菌全基因组测序结果进行分析及对实验室保存的沙门菌检测发现，其具有一段共同的特异序列。针对该特异序列设计上、下游引物，PCR扩增后进行电泳分析，与阳性对照有相同条带的判定为疑似阳性，回收疑似阳性的扩增产物，进行测序分析，与SEQIDNO.3所示序列相同或同源性达99％以上的判定为沙门菌阳性。该检测方法操作简单，敏感性和特异性高，与沙门菌的种属结果一致，检测费用低，具有良好的推广应用价值。附图说明图1为试验例1中沙门菌扩增产物的电泳图；图2为试验例2中扩增产物的电泳图。具体实施方式下述实施例仅对本专利技术作进一步详细说明，但不构成对本专利技术的任何限制。实施例1本实施例中基于特异序列的沙门菌检测引物如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示。实施例2本实施例中基于特异序列的沙门菌检测试剂盒，包含：2×TaqPCRMasterMix(0.1U/μLTaqDNAPolymerase，2×PCR反应缓冲液，0.4mMdNTP，4mMMgSO4)20mL，灭菌超纯水30mL，阳性对照DNA(沙门菌)100μL，8μmol/L上、下游引物各5mL，DNAMarkerDL2000(250μL)及试剂盒说明书一份；所述上、下游引物为：上游引物：5'-AAAGGAACGGGTTGCTGTAA-3'，下游引物：5'-TATCAGGACGTTTTTTCCGC-3'。检测原理：试剂盒中含有聚合酶链式反应所需的各种试剂组分，如引物、dNTPs、缓冲液、Taq酶等，在PCR反应液中加入检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
沙门菌检测引物，其特征在于：所述引物根据特异序列或者与该序列同源性达99％以上的同源序列设计合成，特异序列如SEQ ID NO.3所示。

【技术特征摘要】
1.沙门菌检测引物，其特征在于：所述引物根据特异序列或者与该序列同源性达99％以上的同源序列设计合成，特异序列如SEQIDNO.3所示。2.根据权利要求1所述的检测引物，其特征在于：所述同源序列如SEQIDNO.4所示。3.根据权利要求1或2所述的检测引物，其特征在于：该引物如下所示：上游引物：5'-AAAGGAACGGGTTGCTGTAA-3'；下游引物：5'-TATCAGGACGTTTTTTCCGC-3'。4.基于特异序列的沙门菌检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包含以下引物：上游引物：5'-AAAGGAACGGGTTGCTGTAA-3'；下游引物：5'-TATCAGGACGTTTTTTCCGC-3'。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：还包含：2×TaqPCRMasterMix、阳性对照及10×PCR菌落增强剂。6.基于特异序列的沙门菌检测方法，其特征在于：包括以下步骤：1)以待测样本基因组DNA或单菌落为模板，利用引物进行PCR扩增，扩增产物经电泳分析与阳性对照有相同条带的判定为疑似阳性；2)回收疑似...

【专利技术属性】
技术研发人员：段广才，梁文娟，陈帅印，张荣光，杨海燕，张卫东，范清堂，郗园林，
申请(专利权)人：郑州大学，新乡医学院，
类型：发明
国别省市：河南,41