用于鉴定番茄颈腐根腐病和枯萎病的病原菌的引物及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于鉴定番茄颈腐根腐病和枯萎病的病原菌的引物及试剂盒，用于鉴定番茄颈腐根腐病的病原菌的引物序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，用于鉴定番茄枯萎病的病原菌的引物序列为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。本发明专利技术引物特异性强，检测准确性高，可用于尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型、尖孢镰刀菌番茄专化型1号生理小种的检测，对番茄颈腐根腐病和枯萎病病害早期快速检测、土壤病菌群体分布及病害的防治具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
用于鉴定番茄颈腐根腐病和枯萎病的病原菌的引物及试剂盒
本专利技术涉及分子生物学
，特别涉及一种用于鉴定番茄颈腐根腐病和枯萎病的病原菌的引物及试剂盒。
技术介绍
番茄(SolanumesculentumL.)是我国最主要的蔬菜之一，估计全国番茄种植面积每年在1000万亩以上，产值在400亿元以上。番茄的种植面积不断扩大，现已可以周年种植，并且产量越来越高，品种花色越来越多，用途广泛，深受种植者和消费者喜爱。目前制约番茄生产的因素除市场行情较难预测外，最主要的就是病虫害较重，番茄的产量和品质难有更大提高。其中，番茄颈腐根腐病(Fusariumcrownandrootrot，FCRR)和枯萎病(TomatoFusariumwilt)是番茄生产中的2种重要的土传病害，广泛分布于全球热带、亚热带和温带地区，是世界性的重要病害，具有寄主范围广、防治困难等特点。番茄颈腐根腐病是由一种死体营养型病原真菌尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型(Fusariumoxysporumf.sp.radicis-lycopersici，FORL)引起，近年来新上升的一种番茄病害，发病率逐年增加病情加重，误诊或防治不及时，番茄发病率达80％以上，致死率达30％以上，造成严重减产，给种植户造成严重的经济损失(程琳等，2016)。番茄枯萎病是由尖孢镰刀菌番茄专化型(Fusariumoxysporumf.sp.lycopersici，FOL)引起的真菌性维管束病害。近年来，随着设施番茄种植面积的扩大和种植年代的增加，由番茄颈腐根腐病菌、枯萎病菌引起的土传病害连作障碍日趋严重，对番茄的产量和品质造成严重威胁，已成为设施番茄安全产业化生产的瓶颈。迄今为止，基于镰刀菌形态学方面的分类鉴定方法很难适用于极易发生突变的镰刀菌，操作复杂并且鉴定准确度低，很容易造成误诊，贻误防治时机、影响防治效果。随着分子生物学技术的不断发展，镰刀菌属的鉴定工作也引入了分子系统学方法，常用于鉴定的主要DNA序列包括：核糖体内转录间隔区(ITS)、基因间的间隔区(IGS)、多聚半乳糖醛酸内切酶(pg1、pg2、pg5)等。因此，找到能够区分尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型(FORL)和尖孢镰刀菌番茄专化型(FOL)病原菌的基因序列，建立一套新的分子生物学鉴定体系，能够快速、准确地鉴定尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型或/和尖孢镰刀菌番茄专化型，该体系的建立将对番茄颈腐根腐病和枯萎病病害早期快速检测、土壤病菌群体分布及病害的防治具有重要意义。不同种类镰刀菌生物学特性不同，明确不同地区致病性镰刀菌的种类、优势种群及致病力，建立高效、快速、准确的病菌检测技术，可为其防治措施的制定奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于鉴定番茄颈腐根腐病和枯萎病的病原菌的引物，特异性强，检测准确性高，对番茄颈腐根腐病和枯萎病病害早期快速检测、土壤病菌群体分布及病害的防治具有重要意义。本专利技术还提供了包含上述引物的试剂盒。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种用于鉴定番茄颈腐根腐病的病原菌的引物，所述病原菌为尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型，所述引物序列如下：ForL-上游引物：5’-CCTTACTCGACATTTTTCAGA-3’；ForL-下游引物：5’-CATCAAGGCATAGTAAGAT-3’。一种用于鉴定番茄枯萎病的病原菌的引物，所述病原菌为尖孢镰刀菌番茄专化型1号生理小种，所述引物序列如下：For-上游引物：5’-GTATGACTCCTCTTATCATA-3’；For-下游引物：5’-GTGGAGTGAGCTTACCGTTA-3’。一种用于鉴定番茄颈腐根腐病的病原菌的试剂盒，所述病原菌为尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型，包括权利要求1所述引物。一种用于鉴定番茄枯萎病的病原菌的试剂盒，所述病原菌为尖孢镰刀菌番茄专化型1号生理小种，包括权利要求2所述引物。一种用于同时鉴定番茄颈腐根腐病和枯萎病的病原菌的试剂盒，番茄颈腐根腐病的病原菌为尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型，番茄枯萎病的病原菌为尖孢镰刀菌番茄专化型1号生理小种，包括盒体和6支PCR管，在2支PCR管中分别装有2×TaqPCRMasterMix和ddH2O；在另外4支PCR管中分别装有检测尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型的ForL-上游引物、ForL-下游引物，以及检测尖孢镰刀菌番茄专化型1号生理小种的For-上游引物、For-下游引物。作为优选，ForL-上游引物序列为：5’-CCTTACTCGACATTTTTCAGA-3’；ForL-下游引物序列为：5’-CATCAAGGCATAGTAAGAT-3’；For-上游引物序列为：5’-GTATGACTCCTCTTATCATA-3’；For-下游引物序列为：5’-GTGGAGTGAGCTTACCGTTA-3’。本专利技术的有益效果是：引物特异性强，检测准确性高，可用于尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型、尖孢镰刀菌番茄专化型1号生理小种的检测，对番茄颈腐根腐病和枯萎病病害早期快速检测、土壤病菌群体分布及病害的防治具有重要意义。附图说明图1为本专利技术引物特异性检测样品DNA扩增后的凝胶电泳图，图中：1：尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型；2：尖孢镰刀菌番茄专化型1号生理小种。图2为本专利技术田间病株上分离菌株DNA扩增后的凝胶电泳图，图中：a：尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型检测；b：尖孢镰刀菌番茄专化型1号生理小种检测；c：尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型和尖孢镰刀菌番茄专化型1号生理小种同时检测。具体实施方式下面通过具体实施例，对本专利技术的技术方案作进一步的具体说明。本专利技术中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。本专利技术中所用引物均由大连宝生物技术公司合成，所有序列测定工作均由上海生物技术有限公司完成。实施例：一、引物设计根据GenBank中pgx4的保守序列(GenBank编号AB256820.1、AB256830.1、AB256818.1、AB256798.1、AB256796.1、AB256797.1、AB256795.1、GU169176.1、AB256825.1)，设计简并引物FL-F(5’-GATGGTGGAACGGTATGACYC-3’，SEQIDNO：5所示)与FL-R(5’-GATATCCTTRACACCATCACA-3’，SEQIDNO：6所示)，扩增长度为960bp，对其片段进行克隆、测序和分析，并在960bp序列内部设计尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型和尖孢镰刀菌番茄专化型1号生理小种特异性引物。尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型特异性引物序列如下：ForL-上游引物：5’-CCTTACTCGACATTTTTCAGA-3’(SEQIDNO：1所示)；ForL-下游引物：5’-CATCAAGGCATAGTAAGAT-3’(SEQIDNO：2所示)；SEQIDNO：1由21个碱基组成，SEQIDNO：2由19个碱基组成，扩增片段长度为210bp。上述引物适用于尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型PCR检测。用上述引物对待测样品进行PCR扩增，扩增产物有210bp大小的条带，则样品中含有尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于鉴定番茄颈腐根腐病的病原菌的引物，所述病原菌为尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型，其特征在于，所述引物序列如下：ForL‑上游引物：5’‑CCTTACTCGACATTTTTCAGA‑3’；ForL‑下游引物：5’‑CATCAAGGCATAGTAAGAT‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种用于鉴定番茄颈腐根腐病的病原菌的引物，所述病原菌为尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型，其特征在于，所述引物序列如下：ForL-上游引物：5’-CCTTACTCGACATTTTTCAGA-3’；ForL-下游引物：5’-CATCAAGGCATAGTAAGAT-3’。2.一种用于鉴定番茄枯萎病的病原菌的引物，所述病原菌为尖孢镰刀菌番茄专化型1号生理小种，其特征在于，所述引物序列如下：For-上游引物：5’-GTATGACTCCTCTTATCATA-3’；For-下游引物：5’-GTGGAGTGAGCTTACCGTTA-3’。3.一种用于鉴定番茄颈腐根腐病的病原菌的试剂盒，所述病原菌为尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型，其特征在于，包括权利要求1所述引物。4.一种用于鉴定番茄枯萎病的病原菌的试剂盒，所述病原菌为尖孢镰刀菌番茄专化型1号生理小种，其特征在于，包括权利要求2所述引物。5.一种用于同时鉴...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶青静，杨悦俭，王荣青，阮美颖，周国治，姚祝平，李志邈，万红建，程远，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：浙江,33