用于鉴定金钱白花蛇的特异性引物、试剂盒及鉴别方法技术

本发明专利技术提供了一种用于鉴定金钱白花蛇的特异性引物、试剂盒及鉴别方法，基于金钱白花蛇的CYTB基因设计了大量的引物，通过对大量引物筛选对比研究，选取了具有种属特异性的引物作为金钱白花蛇的特征性鉴别指标。使用上述引物对待测中药金钱白花蛇进行鉴定，能将金钱白花蛇药材与其他混淆品准确的分开，且其PCR扩增产物仅为100～250bp，分子量小，保证了其能在短时间内进行大量的中药金钱白花蛇鉴定，同时鉴定结果显示，此方法具有准确、稳定、可靠、特异性强和灵敏度高等优点，可广泛适用于中药金钱白花蛇的鉴定。

【技术实现步骤摘要】
用于鉴定金钱白花蛇的特异性引物、试剂盒及鉴别方法
本专利技术属于中药材鉴定
，具体涉及一种用于鉴定金钱白花蛇的特异性引物、试剂盒及鉴别方法。
技术介绍
金钱白花蛇为《中国药典》2015年版一部收载的一种常用药材，来源于眼镜蛇科动物银环蛇(BungarusmulticinctusBlyth)的幼蛇干燥体，具有祛风、通络、止痉的功效。临床用于治疗风湿顽痹，麻木拘挛，中风口眼斜，半身不遂，抽搐痉挛，破伤风，麻风等病症。金钱白花蛇作为一种常用的名贵中药材，主要分布于我国浙江、广东、广西、云南和贵州等省份。近年来，由于生态环境不断地恶化以及金钱白花蛇产卵率较低等因素致使其药材资源急剧减少，又鉴于其疗效确切，使用量大，饲养条件和技术要求严格，导致金钱白花蛇价格节节攀升。在利益驱使下，一些不法商家以次充好，使得商品中常充斥着混杂和伪品。比较常见的伪品有赤链蛇、铅色水蛇和金环蛇等。针对金钱白花蛇严重的造假情况，研究人员利用分子生物学PCR技术来对金钱白花蛇真伪进行鉴别，如中国专利文CN101613759A中公开的鉴定金钱白花蛇的PCR方法及其特异引物，通过对金钱白花蛇的CYTB基因片段设计引物并进行PCR特异性扩增、电泳检测即可完成对样品真伪的鉴别。然而上述方案中采用的引物进行扩增的产物分子量为565bp，分子量大，导致其电泳时间长，检测效率低，并且鉴定结果准确度和灵敏度低、种属特异性差，对于种属相近的蛇鉴别困难。
技术实现思路
本专利技术要解决的第一个技术问题在于提供一种用于鉴定中药金钱白花蛇的特异性引物，采用所述引物鉴定中药金钱白花蛇，鉴定结果准确、稳定、可靠、特异性强和灵敏度高，能够在短时间内对大量待测中药金钱白花蛇进行快速鉴定。本专利技术要解决的第二个技术问题在于提供一种用于鉴定中药金钱白花蛇的试剂盒，采用所述试剂盒鉴定中药金钱白花蛇，鉴定结果准确、稳定、可靠、特异性强和灵敏度高，能够在短时间内对大量待测中药金钱白花蛇进行快速鉴定。本专利技术要解决的第三个技术问题在于提供一种用于鉴定中药金钱白花蛇的方法，采用所述方法鉴定中药金钱白花蛇，鉴定结果准确、稳定、可靠、特异性强和灵敏度高，能够在短时间内对大量待测中药金钱白花蛇进行快速鉴定。为此，本专利技术提供了一种用于鉴定中药金钱白花蛇的引物，所述引物序列如下：上游引物：5′-CCCGCTCCATAACCTTTCGT-3′；下游引物：5′-TCAGTTCAGCCGAGTAAGGG-3′。本专利技术提供了一种用于鉴定中药金钱白花蛇的试剂盒，含有所述的引物。本专利技术所述的试剂盒，每支所述试剂盒包括各自独立包装的引物液部分和PCR反应液部分；所述PCR反应液部分含有用于进行PCR扩增的含Mg2+扩增缓冲液、dNTPs、TaqDNA聚合酶以及ddH2O。本专利技术提供了一种所述的引物或所述的试剂盒在鉴定中药金钱白花蛇中的应用。本专利技术提供了一种鉴定中药金钱白花蛇的方法，包括如下步骤：(1)提取待测中药金钱白花蛇的总DNA，备用；(2)以步骤(1)中提取的DNA为模板，采用如下引物进行PCR扩增：上游引物:5′-CCCGCTCCATAACCTTTCGT-3′；下游引物:5′-TCAGTTCAGCCGAGTAAGGG-3′。(3)测定步骤(2)中所得的PCR扩增产物的大小，若所述PCR扩增产物中含有100～250bp的DNA片段，则所述待测中药金钱白花蛇为真；反之，则所述待测中药金钱白花蛇为假。所述的方法，所述步骤(2)中，所述PCR反应体系包括：DNA模板，100ng，2μL；上游引物，10μM，1μL；下游引物，10μM，1μL；2×EasyPCRSuperMix，10μL；ddH2O，8μL；反应总体积为22μL。(4)所述的方法步骤(2)中，PCR扩增程序如下：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，进行30个循环，然后继续72℃延伸5min，降温至4℃，获得的扩增产物4℃保存。所述的方法(3)中100～250bp的DNA片段为181bp。所述的方法181bp的DNA片段序列如SEQ.IDNO：3所示。本专利技术技术方案，具有如下优点：(1)本专利技术所述的用于鉴定中药金钱白花蛇的特异性引物，基于金钱白花蛇的CYTB基因设计了大量的引物，通过对大量引物筛选研究，筛选出了具有种属特异性的引物，使用上述引物对待测中药金钱白花蛇进行鉴定，能将金钱白花蛇药材与其他混淆品准确的分开，且其PCR扩增产物仅为100～250bp，分子量小，保证了其能在短时间内进行大量的中药金钱白花蛇鉴定，同时鉴定结果显示，此方法具有准确、稳定、可靠、特异性强和灵敏度高等优点，可广泛适用于中药金钱白花蛇的鉴定。(2)本专利技术所述的用于鉴定中药金钱白花蛇的试剂盒，所述试剂盒中含有所述的用于鉴定中药金钱白花蛇的特异性引物，所述引物具有种属特异性，使用上述引物对待测中药金钱白花蛇进行鉴定，能将金钱白花蛇药材与其他混淆品准确的分开，在短时间内进行大量的中药金钱白花蛇鉴定，同时鉴定结果显示，此方法具有准确、稳定、可靠、特异性强和灵敏度高等优点，可广泛适用于中药金钱白花蛇的鉴定。(3)本专利技术所述的鉴定中药金钱白花蛇的方法，采用本专利技术设计的引物进行PCR扩增，若所述PCR扩增产物中含有100～250bp的DNA片段，且所述100～250bp的DNA片段为181bp的DNA片段，则所述待测中药金钱白花蛇为真；反之，则所述待测中药金钱白花蛇为假；所述方法能将金钱白花蛇药材与其他混淆品准确的分开。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见的，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术实施例3中的琼脂糖凝胶电泳图。具体实施方式本专利技术下述实施中所使用的主要试剂如下：EasyGenomicDNAKit、2×EasyPCRSuperMix(+dye)和Trans2KPlusDNAMarker均购自北京全式金生物技术公司。本专利技术下述实施中所使用的主要设备如下：ST16R高速冷冻离心机购自赛默飞世尔、V-GES电泳仪购自威泰克、DolphinView凝胶成像系统购自威泰克。实施例1本实施例提供了一种用于鉴定中药金钱白花蛇的特异性引物，针对金钱白花蛇的CYTB基因设计的特异性引物如下，参见序列表中SEQIDNO：1-2所示：上游引物：5′-CCCGCTCCATAACCTTTCGT-3′；下游引物：5′-TCAGTTCAGCCGAGTAAGGG-3′；上述引物由上海英潍捷基公司(北京合成部)合成。实施例2本实施例提供了一种用于鉴定中药金钱白花蛇的试剂盒，每支所述试剂盒包括各自独立包装的引物液部分和PCR反应液部分；所述引物液为含所述实施例1中的所述特异性引物；所述PCR反应液部分含有用于进行PCR扩增的含Mg2+扩增缓冲液、dNTPs、TaqDNA聚合酶以及ddH2O，每支所述试剂盒的配方为：上游引物，10μM，1μL；下游引物，10μM，1μL；2×EasyPCRSuperMix，10μL；ddH2O，8μL；总体积为20μL。实本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于鉴定中药金钱白花蛇的特异性引物，其特征在于，所述引物序列如下：上游引物：5′‑CCCGCTCCATAACCTTTCGT‑3′；下游引物：5′‑TCAGTTCAGCCGAGTAAGGG‑3′。

【技术特征摘要】
1.一种用于鉴定中药金钱白花蛇的特异性引物，其特征在于，所述引物序列如下：上游引物：5′-CCCGCTCCATAACCTTTCGT-3′；下游引物：5′-TCAGTTCAGCCGAGTAAGGG-3′。2.一种用于鉴定中药金钱白花蛇的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的引物。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，每支所述试剂盒包括各自独立包装的引物液部分和PCR反应液部分；所述PCR反应液部分含有用于进行PCR扩增的含Mg2+扩增缓冲液、dNTPs、TaqDNA聚合酶以及ddH2O。4.一种如权利要求1所述的引物或权利要求2或3所述的试剂盒在鉴定中药金钱白花蛇中的应用。5.一种鉴定中药金钱白花蛇的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取待测中药金钱白花蛇的总DNA，备用；(2)以步骤(1)中提取的DNA为模板，采用如下引物进行PCR扩增：上游引物:5′-CCCGCTCCATAACCTTTCGT-3′；下游引物:5′-TCAGTTCAGCCGAGTAAGGG-3′。(3)测定步骤(2)中所得的PCR扩增产物的大小，若所述PCR扩增产物中...

【专利技术属性】
技术研发人员：李建生，
申请(专利权)人：北京建生药业有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11