本发明专利技术公开一种鲜动物药药物组合物及其原料药的含量测定方法，该方法为：取本发明专利技术鲜动物药药物组合物和原料药，置于量瓶中，加水溶解，超声提取，离心，取上清液，过微孔滤膜，得游离氨基酸供试品溶液；称取本发明专利技术鲜动物药药物组合物和原料药，加水充分溶解后，超声提取，离心，取上清液，置于安剖瓶中，加入盐酸，真空充氮，水解，取出，放冷至室温，加入NaOH溶液，混匀，转移至量瓶中，加水稀释并定容至刻度，混匀，离心，取上清液，过微孔滤膜，得总氨基酸供试品溶液。以色谱柱检测一级氨基酸和二级氨基酸。以乙腈：甲醇：水为流动相A，pH为7.8的Na2HPO4为流动相B，进行梯度洗脱。本发明专利技术方法操作简单，分辨率高、灵敏度高，并可在短时间内分离鲜动物药药物组合物及其原料药中12～26种氨基酸，是一种可靠的氨基酸含量测定方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种测定方法，特别是涉及一种治疗原发性肝癌血瘀郁结证的鲜动物药药物组合物及其原料药的含量测定方法。
技术介绍
本专利技术金龙胶囊(国药准字Z10980041)是癌症治疗药物，以药用动物(鲜守宫、 鲜蕲蛇、鲜金钱白花蛇)组方的复方制剂，在抗肿瘤方面疗效确切。金龙胶囊已颁布的药品标准(WS3-158(Z-036)_2001Z)对其产品质量的控制，包括性状、鉴别、检查和含量测定4项，从目前SFDA对中药质量控制标准的要求，以及金龙胶囊原料药鲜守宫、鲜金钱白花蛇、鲜蕲蛇的化学及药理研究现状来看，目前含量测定项目采用了可见分光光度法，Folin-酚试剂测定总蛋白，该法的特异性较差，此外对于动物药中普遍存在的氨基酸、游离单糖、多糖及内源性一些小分子生命基本物质均未进行质量控制研根据金龙胶囊质量控制标准现状，本专利技术以质量控制标准提高为出发点，对金龙胶囊中氨基酸进行测定，确定了金龙胶囊氨基酸检测的色谱条件，该色谱条件采用柱前衍生化法，方法学考察中精密度、稳定性及重现性良好。并且金龙胶囊中含有大量氨基酸，应用氨基酸测定可更好的控制药品质量。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种鲜动物药药物组合物的含量测定方法。本专利技术的另一目的在于提供一种鲜动物药药物组合物原料药的含量测定方法。本专利技术是通过如下技术方案实现的本专利技术药物组合物的含量测定方法包括如下步骤1、标准品溶液的制备a、0. lmol/L盐酸溶液取36% -38%的浓盐酸0. 83体积份于100体积份量瓶中， 加水稀释并定容至刻度；b、17种氨基酸混合标准品溶液17种氨基酸分别天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、 组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸；取17种氨基酸混合标准品溶液(购于安捷伦公司)25 μ L、50 μ L、100 μ L、200 μ L、 400μ L、800y L于0. 5-1. 5体积份容量瓶中，以0. lmol/L盐酸水溶液稀释并定容至刻度，得 25-1000pmol/μ L系列浓度的氨基酸混合标准品溶液；c、l%苯酚的6mol/L盐酸溶液取苯酚0. 2-0. 8重量份于30_70体积份棕色量瓶中，加入浓盐酸15-35体积份，加水溶解并定容至刻度；dU0mol/L NaOH溶液取NaOH 10_30重量份，置于30-70体积份量瓶中，加水溶解并定容至刻度，混勻，转移至塑料储瓶中备用；e、40mol/L Na2HPO4缓冲液取NaH2PO4 3-8重量份，加水溶解并定容于500-1500 体积份量瓶中，用lOmol/L NaOH溶液调节pH值至7. 8，混勻，即得；2.供试品溶液的制备a、游离氨基酸供试品溶液的制备称取本专利技术药物组合物0. 05-0. 15重量份，置于25-75体积份量瓶中，加水溶解并定容至刻度，超声提取15-45分钟，离心5_15分钟，取上清液，过0. 3-0. 6 μ m微孔滤膜，得游离氨基酸供试品溶液；b、总氨基酸供试品溶液的制备称取本专利技术药物组合物0.05-0. 15重量份，置于 10-20体积份塑料离心管中，加水5-15体积份充分溶解后，超声提取15-45分钟，离心5_15 分钟，取上清液，取0. 05-1. 5体积份上清液，置于安剖瓶中，加入含苯酚的6mol/L盐酸 2-6体积份，真空充氮N215-45秒，迅速密封，置于80-150°C恒温干燥箱内水解12-32小时， 取出，放冷至室温，加入1. 2-3. 6体积份lOmol/L NaOH溶液，混勻，转移至5_15体积份量瓶中，加水稀释并定容至刻度，混勻，离心5-15分钟，取上清液，过0. 45 μ m微孔滤膜，得总氨基酸供试品溶液；3、色谱条件色谱柱4. 6 X 150mm，3. 5μπι Zorbax Ecl ipse-AAA 柱，流速1. 5ml/min，柱温为 35°C，自动进样程序，紫外检测器于338nm处检测一级氨基酸，于波长处检测二级氨基酸；以乙腈甲醇水=25-65 25-65 5-15为流动相A，pH为7. 8的4(toimol/L Na2HPO4为流动相B，进行梯度洗脱，梯度洗脱程序如下0-2. 5min流动相A为0%，流动相B为100% ； 2. 5-16min 流动相 A 为 30 %，流动相 B 为 70 % ；16-24min流动相A为57 %，流动相B为43 % ；24-24. 8min 流动相 A 为 100 %，流动相 B 为 0 % ；24. 8-29. 7min 流动相 A 为 100 %，流动相 B 为 0 % ；29. 7-30. 9min 流动相 A 为 0%，流动相 B 为 100% ；30. 9-34. 7min 流动相 A 为 0%，流动相 B 为 100% ；4、测定结果本专利技术药物组合物中检测到14种氨基酸，其中总蛋白质的含量为1. 9% -2. 85%, 总游离氨基酸的含量为12. 52% -18. 78%，总氨基酸的含量为14.41% -21.62% ；本专利技术药物组合物的含量测定方法优选如下步骤1、标准品溶液的制备a、0. lmol/L盐酸溶液取37. 5%浓盐酸0. 83体积份于100体积份量瓶中，加水稀释并定容至刻度；b、17种氨基酸混合标准品溶液的制备17种氨基酸分别天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、 异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸；取17种氨基酸混合标准品溶液(购于安捷伦公司)25μ LjOyLUOOy L、 200 μ L、400 μ L、800 μ L于1体积份量瓶中，以0. lmol/L盐酸水溶液稀释并定容至刻度，得 25-ΙΟΟΟρπιοΙ/μ L系列浓度的氨基酸混合标准品溶液；c、l%苯酚的6mol/L盐酸溶液取苯酚0. 5重量份于50体积份棕色量瓶中，加入浓盐酸25体积份，加水溶解并定容至刻度；dU0mol/L NaOH溶液取NaOH 20. 0重量份，置于50体积份量瓶中，加水溶解并定容至刻度，混勻，转移至塑料储瓶中备用；e、40mol/L Na2HPO4缓冲液取NaH2PO4 5. 5重量份，加水溶解并定容于1000体积份量瓶中，用lOmol/LNaOH溶液调节pH值至7. 8，混勻，即得；2.供试品溶液的制备a、游离氨基酸供试品溶液的制备称取本专利技术药物组合物0. 1重量份，置于50体积份量瓶中，加水溶解并定容至刻度，超声提取30分钟，离心10分钟，取上清液，过0. 45 μ m 微孔滤膜，得游离氨基酸供试品溶液；b、总氨基酸供试品溶液的制备称取本专利技术药物组合物0. 1重量份，置于15体积份塑料离心管中，加水10体积份充分溶解后，超声提取30分钟，离心10分钟，取上清液，取 1体积份上清液，置于安剖瓶中，加入含1 %苯酚的6mol/L盐酸4体积份，真空充氮N230秒， 迅速密封，置于110°c恒温干燥箱内水解22小时，取出，放冷至室温，分别加入2. 4体积份 10mol/L NaOH溶液，混勻，转移至10体积份量瓶中，加水稀释并定容至刻度，混勻，离心10 分钟，取上清液，过0. 45 μ m微孔滤膜，得总氨基酸供试品溶液；本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种药物组合物的含量测定方法，其特征在该方法为包括如下步骤：（１）标准品溶液的制备ａ、０．１ｍｏｌ／Ｌ盐酸溶液取３６％－３８％的浓盐酸０．８３体积份于１００体积份量瓶中，加水稀释并定容至刻度；ｂ、系列浓度１７种氨基酸混合标准品溶液１７种氨基酸分别：天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸；取１７种氨基酸混合标准品溶液２５μＬ、５０μＬ、１００μＬ、２００μＬ、４００μＬ、８００μＬ于０．５－１．５体积份容量瓶中，以０．１ｍｏｌ／Ｌ盐酸水溶液稀释并定容至刻度，得２５－１０００ｐｍｏｌ／μＬ系列浓度的氨基酸混合标准品溶液；ｃ、１％苯酚的６ｍｏｌ／Ｌ盐酸溶液取苯酚０．２－０．８重量份于３０－７０体积份棕色量瓶中，加入浓盐酸１５－３５体积份，加水溶解并定容至刻度；ｄ、１０ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ溶液取ＮａＯＨ １０－３０重量份，置于３０－７０体积份量瓶中，加水溶解并定容至刻度，混匀，转移至塑料储瓶中备用；ｅ、４０ｍｏｌ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４缓冲液取ＮａＨ２ＰＯ４ ３－８重量份，加水溶解并定容于５００－１５００体积份量瓶中，用１０ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ溶液调节ｐＨ值至７．８，混匀，即得；（２）供试品溶液的制备ａ、游离氨基酸供试品溶液的制备称取药物组合物０．０５－０．１５重量份，置于２５－７５体积份量瓶中，加水溶解并定容至刻度，超声提取１５－４５分钟，离心５－１５分钟，取上清液，过０．３－０．６μｍ微孔滤膜，得游离氨基酸供试品溶液；ｂ、总氨基酸供试品溶液的制备称取药物组合物０．０５－０．１５重量份，置于１０－２０体积份塑料离心管中，加水５－１５体积份充分溶解后，超声提取１５－４５分钟，离心５－１５分钟，取上清液，取０．０５－１．５体积份上清液，置于安剖瓶中，加入含１％苯酚的６ｍｏｌ／Ｌ盐酸２－６体积份，真空充氮Ｎ２１５－４５ 秒，迅速密封，置于８０－１５０℃恒温干燥箱内水解１２－３２小时，取出，放冷至室温，加入１．２－３．６体积份１０ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ溶液，混匀，转移至５－１５体积份量瓶中，加水稀释并定容至刻度，混匀，离心５－１５分钟，取上清液，过０．４５μｍ微孔滤膜，得总氨基酸供试品溶液；（３）色谱条件色谱柱：４．６×１５０ｍｍ，３．５μｍ Ｚｏｒｂａｘ Ｅｃｌｉｐｓｅ－ＡＡＡ柱，流速：１．５ｍｌ／ｍｉｎ，柱温为３５℃，自动进样程序，紫外检测器于３３８ｎｍ处检测一级氨基酸，于２６２ｎｍ波长处检测二级氨基酸；以乙腈∶甲醇∶水＝２５－６５∶２５－６５∶５－１５为流动相Ａ，ｐＨ为７．８的４０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４为流动相Ｂ，进行梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：０－２．５ｍｉｎ流动相Ａ为０％，流动相Ｂ为１００％；２．５－１６ｍｉｎ流动相Ａ为３０％，流动相Ｂ为７０％；１６－２４ｍｉｎ流动相Ａ为５７％，流动相Ｂ为４３％；２４－２４．８ｍｉｎ流动相Ａ为１００％，流动相Ｂ为０％；２４．８－２９．７ｍｉｎ流动相Ａ为１００％，流动相Ｂ为０％；２９．７－３０．９ｍｉｎ流动相Ａ为０％，流动相Ｂ为１００％；３０．９－３４．７ｍｉｎ流动相Ａ为０％，流动相Ｂ为１００％；（４）测定结果所述药物组合物中检测到１４种氨基酸，其中总蛋白质的含量为１．９％－２．８５％，总游离氨基酸的含量为１２．５２％－１８．７８％，总氨基酸的含量为１４．４１％－２１．６２％；所述药物组合物的原料药组成为：鲜守宫７００－２３００重量份 鲜金钱白花蛇４００－１１００重量份鲜蕲蛇４００－１１００重量份。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李建生，
申请(专利权)人：北京建生药业有限公司，
类型：发明
国别省市：11
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。