用于检测miR‑874‑3p表达的引物、试剂盒、检测方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种用于检测miR‑874‑3p表达的引物、试剂盒、检测方法及应用，属于肿瘤生物治疗技术领域。本发明专利技术通过试验证实miR‑874‑3p与长春新碱的耐药性相关，在长春新碱耐药细胞中高表达、敏感细胞中低表达，因此可以作为肿瘤细胞长春新碱耐药的标志物。根据该标志物设计的引物、试剂盒及检测方法可用于临床判断肿瘤细胞对长春新碱的耐药性，进一步指导临床用药并实现精准治疗。

【技术实现步骤摘要】
用于检测miR-874-3p表达的引物、试剂盒、检测方法及应用
本专利技术涉及一种用于检测miR-874-3p表达的引物，同时还涉及包含该引物的试剂盒和检测方法，以及miR-874-3p在制备拮抗肿瘤耐长春新碱的药物中的应用，属于肿瘤生物治疗

技术介绍
结直肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，发生于结肠部位，好发于直肠与乙状结肠交界处。结直肠癌以40～50岁年龄组的发病率最高，男女之比为2～3:1。在西方发达国家，结直肠癌的发病率居第3位。在我国，结直肠癌的发病率居第4位，且发病率和致死率呈逐年递增的趋势。临床数据表明，结直肠癌的转移率高、早期诊断率低，手术切除后易复发是造成结直肠癌致死率高的主要原因。彻底切除结直肠癌是最有效的治疗方法，术后化疗在延长病人生存和改善生活质量方面有着重要作用。长春新碱(vincristine，VCR)是目前应用广泛的抗肿瘤化疗药物，用于结肠癌的临床治疗，但是长期治疗会使肿瘤细胞产生耐药性，导致化学治疗失败。数据显示，90％的癌症患者死亡与肿瘤的耐药性相关。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于检测miR-874-3p表达的引物。其次，本专利技术提供一种包含上述引物的试剂盒。次之，本专利技术提供一种检测miR-874-3p表达的方法。再次，本专利技术提供一种上述引物、试剂盒的应用。同时，本专利技术提供一种miR-874-3p在制备拮抗肿瘤细胞耐药性药物中的应用。最后，本专利技术提供一种用于治疗肿瘤的药物组合物。为了实现以上目的，本专利技术所采用的技术方案是：用于检测miR-874-3p表达的引物，根据miR-874-3p序列(如SEQIDNO:1所示)设计合成，包括逆转录引物和荧光定量PCR引物。逆转录引物如SEQIDNO:2、3或4所示。荧光定量PCR引物中正向引物如SEQIDNO:5或6所示，反向引物如SEQIDNO:7所示。所述肿瘤为结直肠癌，产生耐药性的药物为长春新碱。用于检测miR-874-3p表达的试剂盒，包括上述引物以及通用的miRNA逆转录试剂(包含逆转录酶和dNTPmix)、荧光定量聚合酶链反应试剂(包含荧光染料、TaqDNA聚合酶和dNTPmix)。所述试剂盒还可以包括DNA消化试剂(包含DNaseI，RNase-free)以及内参的逆转录引物和荧光定量PCR引物。当内参采用U6snRNA管家基因时，内参的逆转录引物如SEQIDNO:10所示，内参的荧光定量PCR的正、反向引物分别如SEQIDNO:8、9所示。检测miR-874-3p表达的方法，包括以下步骤：1)以细胞总RNA为模板，逆转录得到cDNA；2)以cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增，检测miR-874-3p的表达量；步骤1)中逆转录的引物包括miR-874-3p的逆转录引物和内参的逆转录引物，miR-874-3p的逆转录引物如SEQIDNO:2、3或4所示；步骤2)中荧光定量PCR扩增的引物包括miR-874-3p的荧光定量PCR引物和内参的荧光定量PCR引物，miR-874-3p的荧光定量PCR引物中正向引物如SEQIDNO:5或6所示，反向引物如SEQIDNO:7所示。步骤1)中逆转录的反应体系为：5×RTbuffer(250mMTris-HCl(pH8.3)、375mMKCl、15mMMgCl2、50mMDTT)4μL，200U/μL逆转录酶1μL，10μMmiR-874-3p的逆转录引物0.5μL，dNTP(2.5mMeach)2.5μL，10μM内参的逆转录引物0.5μL，1.0μg/μLRNA1μL，无RNA酶水补足至20μL。步骤1)中逆转录的反应条件为：16℃30min，42℃30min，85℃灭活逆转录酶5min；反应结束后将其放在冰上待用或-20℃保存。步骤2)中荧光定量PCR扩增的反应体系为：dNTP(2.5mMeach)2.5μL，2×SYBRGreenPCRMasterMix(购自ABI公司)10μL，1.0μg/μLcDNA1μL，10μMmiR-874-3p的正、反向引物各0.5μL，10μM内参的正、反向引物各0.5μL，双蒸水补足至20μL。步骤2)中荧光定量PCR扩增的反应条件为：95℃变性5min，40个循环(95℃15s，60℃15s，72℃20s)，95℃15s，60℃30s，95℃15s。步骤2)中检测miR-874-3p的表达量以U6snRNA管家基因作为内参，采用相对定量法。内参U6snRNA的逆转录引物如SEQIDNO:10所示，荧光定量PCR扩增的正、反向引物分别如SEQIDNO:8、9所示。上述引物、试剂盒在判断肿瘤细胞对长春新碱耐药性方面的应用。上述引物、试剂盒在筛选拮抗肿瘤细胞对长春新碱耐药性药物中的应用。miR-874-3p在制备拮抗肿瘤细胞耐药性药物中的应用。具体为：参照miR-874-3p序列设计合成miR-874-3p抑制物，以治疗有效量的miR-874-3p抑制物和药用辅料为原料制备拮抗肿瘤细胞耐药性的药物。用于治疗肿瘤的药物组合物，包括治疗有效量的miR-874-3p抑制物和治疗有效量的长春新碱。本专利技术的有益效果：本专利技术通过试验证实microRNA分子miR-874-3p与长春新碱的耐药性相关，miR-874-3p在长春新碱耐药细胞中高表达、敏感细胞中低表达，因此可以作为肿瘤细胞长春新碱耐药的标志物。根据该标志物设计的引物、试剂盒及检测方法可用于临床判断肿瘤细胞对长春新碱的耐药性，进一步指导临床用药并实现精准治疗，提高疗效，降低副作用。本专利技术为设计肿瘤细胞长春新碱耐药药物提供了新的靶点，可用于直接开发拮抗肿瘤细胞长春新碱耐药性的药物。又由于miR-874-3p抑制物具有降低肿瘤细胞耐药的生物学功能，将其与治疗有效量的长春新碱联合使用，可以提高癌症的化疗效果，为有效逆转肿瘤细胞长春新碱耐药以及提高肿瘤细胞的临床化疗效果提供有效途径。附图说明图1为结肠癌细胞原代消化后在VCR下的细胞存活率；图2为结肠癌细胞HCT-8及HCT-8/VCR在不同VCR浓度下的相对存活率；图3为HCT-8、HCT-8/VCR细胞中hsa-miR-874-3p的表达水平；图4为HCT-8细胞转染hsa-miR-874-3p模拟物(minics)后对长春新碱的耐药能力；图5为HCT-8/VCR细胞转染has-miR-874-3p抑制物(inhibitor)后对长春新碱的耐药能力。具体实施方式下述实施例仅对本专利技术作进一步详细说明，但不构成对本专利技术的任何限制。实施例1用于检测miR-874-3p表达的引物，根据miR-874-3p序列(如SEQIDNO:1所示)设计合成，包括逆转录引物和荧光定量PCR引物，逆转录引物如SEQIDNO:2、3或4所示，荧光定量PCR引物中正向引物如SEQIDNO:5或6所示，反向引物如SEQIDNO:7所示。实施例2用于检测miR-874-3p表达的试剂盒，包括实施例1中引物以及内参U6snRNA的逆转录引物(如SEQIDNO:10所示)和荧光定量PCR引物(正、反向引物如SEQIDNO:8、9所示)，还包括通用的DNA消化试剂(DNaseI(RNase-free)、EDPC等)、miRNA逆转录试剂(逆转录酶、5×RTbuf本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测miR‑874‑3p表达的引物，其特征在于：包括逆转录引物和荧光定量PCR引物，逆转录引物如SEQ ID NO:2、3或4所示，荧光定量PCR引物中正向引物如SEQ ID NO:5或6所示，反向引物如SEQ ID NO:7所示。

【技术特征摘要】
2017.02.15 CN 20171008159661.用于检测miR-874-3p表达的引物，其特征在于：包括逆转录引物和荧光定量PCR引物，逆转录引物如SEQIDNO:2、3或4所示，荧光定量PCR引物中正向引物如SEQIDNO:5或6所示，反向引物如SEQIDNO:7所示。2.包含如权利要求1中所述引物的试剂盒。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括miRNA逆转录试剂和荧光定量PCR反应试剂。4.检测miR-874-3p表达的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)以细胞总RNA为模板，逆转录得到cDNA；2)以cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增，检测miR-874-3p的表达量；步骤1)中逆转录的引物包括miR-874-3p的逆转录引物和内参的逆转录引物，miR-874-3p的逆转录引物如SEQIDNO:2、3或4所示；步骤2)中荧光定量PCR扩增的引物包括miR-874-3p的荧光定量PCR引物和内参的荧光定量PCR引物，miR-874-3p的荧光定量PCR引物中正向引物如S...

【专利技术属性】
技术研发人员：王天云，董卫华，高建辉，林艳，郭潇，王燕芳，
申请(专利权)人：新乡医学院，
类型：发明
国别省市：河南,41