本发明专利技术涉及生物技术领域，提供了一种引物-固相载体复合物及其制备方法和应用。一种引物-固相载体复合物，包括引物和固相载体，该固相载体包括第一固相载体和第二固相载体，该第一固相载体与至少一个第二固相载体结合，该第二固相载体与至少一个引物结合。本发明专利技术的引物-固相载体复合物具有高引物结合密度的特性，能大大提高固相表面的PCR扩增效率，降低在后续的扩增反应中对操作人员的操作要求。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，更具体地说，涉及。
技术介绍
高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA 分子进行序列测定，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能。目前高通量测序平台对样品处理的方式主要有两种，分别是通过玻片桥式PCR 进行样品处理和通过乳液PCR进行样品处理。其中玻片桥式PCR进行样品处理的原理如下芯片表面上随机分布有分别与非对称接头互补的引物，单链DNA两端加上非对称的接头，并利用两端的接头与相应的引物互补，从而将片段固定在芯片表面形成寡核苷酸桥。经过多个PCR热循环，成千上万的复制产物制备出来，每一簇都分别固定在芯片表面一个单一的物理位置上。但是，芯片表面为一平面，能够用于与非对称接头互补的引物结合的位点有限，且各引物与单链DNA的结合均在同一水平面上，相互之间存在一定的空间位阻，不利于后续的PCR扩增反应。乳液PCR最大的特点是可以形成数目庞大的独立反应空间以进行DNA扩增。其关键技术是“注水到油”，基本过程是在PCR反应前，将包含PCR所有反应成分的水溶液注入到高速旋转的矿物油表面，水溶液瞬间形成无数个被矿物油包裹的小水滴。这些小水滴就构成了独立的PCR反应空间。理想状态下，每个小水滴只含一个DNA模板和一个Pl磁珠，由于水相中的P2引物和磁珠表面的Pl引物所介导的PCR反应，这个DNA模板的拷贝数量呈指数级增加，PCR反应结束后，Pl磁珠表面就固定有拷贝数目巨大的同来源DNA模板扩增产物。但是，“注水到油”这个技术需要专业人员进行操作，且对操作人员的技术要求很高，极容易失败，同时整个乳液PCR流程中需要用到多种专用仪器(如乳浊液震荡仪、PCR仪、乳浊液破碎仪等)，另外乳液PCR对磁珠的利用效率较低，扩增完成后还需专门的步骤富集带有扩增产物的磁珠，然后才能进行后续的测序反应。因此，需要一种新的引物-固相载体复合物，该引物-固相载体复合物具有高引物结合密度特性，能大大提高固相表面的PCR扩增效率，降低在后续的扩增反应中对操作人员的操作要求。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种引物-固相载体复合物，旨在解决引物-固相载体的引物结合密度偏低，固相表面的PCR扩增效率偏低，在后续的扩增反应中对操作人员的高操作要求。同时，本专利技术还提供了这种引物-固相载体复合物的制备方法，此外，本专利技术还提供了利用这种引物-固相载体复合物进行PCR扩增的方法，以及这种引物-固相载体复合物在核酸测序过程中的应用。本专利技术是这样实现的，一种引物-固相载体复合物，包括引物和固相载体，该固相载体包括第一固相载体和第二固相载体，该第一固相载体与至少一个第二固相载体结合， 该第二固相载体与至少一个引物结合。优选地，该引物与第二固相载体之间的结合方式包括通过引物与第二固相载体携带的基团相互配对，实现直接结合；或者通过中间子携带的基团与引物、第二固相载体携带的基团分别配对，实现间接结合。该中间子用于结合引物和第二固相载体。优选地，该第一固相载体与第二固相载体之间的结合方式包括通过第一固相载体与第二固相载体携带的基团相互配对，实现直接结合；或者通过连接子携带的基团与第一固相载体、第二固相载体携带的基团分别配对，实现间接结合。该连接子用于结合第一固相载体和第二固相载体。更优选地，上述基团的配对可采用各种形式，包括但不限于生物素-亲和素/链霉亲和素、纳米金/碘乙酰(iodacetyl)-巯基、氨基-醛基/羧基/异硫氰基、硅烷基_丙烯酰胺。上述任一方案中，第一固相载体的表面可为各种表面类型，包括但不限于平面、弧面、波浪形表面、不规则表面或这些表面类型的结合。上述任一方案中，第二固相载体可为各种形状，包括但不限于球状固相载体、半球状固相载体、椭球状固相载体、柱状固相载体或不规则形状的固相载体。上述任一方案中，第一固相载体的表面为适于固定生物基团或化学基团的材料， 所述固定包括共价键连接。本专利技术还提供了一种上述的引物-固相载体复合物的制备方法，该方法包括A.第二固相载体与至少一个引物结合；B.第一固相载体与至少一个第二固相载体结合；该步骤A、B无先后顺序。优选地，该步骤A中的第二固相载体与引物之间的结合为直接结合或通过中间子间接结合。该中间子用于结合引物和第二固相载体。更优选地，该步骤A中的第二固相载体与引物之间的结合为通过中间子间接结合，所述步骤A包括以下步骤Al.第二固相载体与至少一个中间子结合；A2.中间子与至少一个引物结合；所述步骤Al、A2无先后顺序。优选地，该步骤B中的第一固相载体与第二固相载体之间的结合为直接结合或通过连接子间接结合。该连接子用于结合第一固相载体和第二固相载体。更优选地，该步骤B中的第一固相载体与第二固相载体之间的结合为通过连接子间接结合，该步骤B包括以下步骤Bi.第一固相载体与至少一个连接子结合；B2.连接子与至少一个第二固相载体结合；所述步骤Bi、B2无先后顺序。更优选地，该步骤A、B2无先后顺序，形成引物-第二固相载体-连接子复合物；然后再进行步骤Bi，形成引物-固相载体复合物。更优选地，该步骤Bl包括Bll.将引物-第二固相载体-连接子复合物溶于碱性溶液中，混勻，然后点样至第一固相载体上，该第一固相载体为表面带有异硫氰基末端的第一固相载体；B12.将点样后的第一固相载体于25至42°C固定0. 5至池，得到引物-固相载体复合物。该碱性溶液为pH值在8. 5至9. 5之间的溶液，如碳酸氢钠溶液、碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris盐酸缓冲液等。本专利技术的引物-固相载体复合物有多种用途，包括但不限于利用所述引物-固相载体复合物作为引物进行PCR扩增；或利用所述引物-固相载体复合物上固定的引物作为探针，进行杂交检测或核酸片段的捕获。本专利技术还提供了一种基于上述任一种引物-固相载体复合物进行PCR扩增的方法，包括以下步骤A.将核酸分子结合到引物-固相载体复合物上；B.在DNA聚合酶或RNA逆转录酶的作用下，引物-固相载体复合物上的引物以其结合的核酸分子为模板进行PCR扩增反应，得到扩增产物。优选地，在步骤A之前包括步骤A’ 制备上述的任一种引物-固相载体复合物。该步骤A’具体可采用上述任一种引物-固相载体复合物的制备方法。优选地，步骤B所述PCR扩增反应为等温PCR扩增反应或热循环PCR扩增反应。等温扩增反应，即在PCR反应过程中，变性、退火和延伸的温度保持一致的PCR扩增反应。热循环PCR扩增反应，即在PCR反应过程中，变性温度和退火温度、延伸温度不同，需循环进行加热、降温的PCR扩增反应。优选地，步骤B所述PCR扩增反应为桥式PCR反应或非桥式PCR反应。桥式PCR 反应，即在PCR反应中用于扩增的上下游引物均被固定，这样扩增产物或用于扩增的模板链可分别通过与上下游引物的结合而成桥。更优选地，步骤B所述PCR扩增反应为桥式PCR等温扩增反应，该桥式PCR等温扩增反应，指其既是等温扩增反应，又是桥式PCR反应。本专利技术还提供了一种利用上述任一种引物-固相载体复合物进行核酸测序的方法，该方法包括以下步骤A.将核酸分子结合到引物-固相载体复合物上；B.在DNA聚合酶或RNA逆转录酶的作用下，引物-固相载体复合物上的引物以其结合的核酸分子为模本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种引物－固相载体复合物，其特征在于，包括引物和固相载体，所述固相载体包括第一固相载体和第二固相载体，所述第一固相载体与至少一个第二固相载体结合，所述第二固相载体与至少一个引物结合。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：盛司潼，
申请(专利权)人：盛司潼，
类型：发明
国别省市：94
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