引物组、锚定引物、试剂盒、文库构建及基因测序方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学领域，提供了一种引物组、锚定引物、文库构建方法及基因测序方法。所述引物组包括第一引物对，所述第一引物对中的上游引物由第一通用区和第一互补区组成；所述第一互补区与所述第一通用区的3’末端连接，所述第一互补区与第一序列完全互补；所述第一序列为待测SNP位点所在序列中的一段序列，处于待测SNP位点的3’端，所述第一序列的5’末端距待测SNP位点1至7bp；所述第一通用区不与第二序列互补；所述第二序列为待测SNP位点所在序列上与第一序列的3’末端连接的一段序列。本发明专利技术能避免因为待测SNP位点附近序列的特殊性而导致的测序结果不准确或测序失败现象的出现。

Primer set, anchor primer, kit, library construction and gene sequencing method

The invention relates to the field of molecular biology, and provides a primer set, an anchor primer, a library construction method and a gene sequencing method. The primer set comprises a first primer, the first primer of upstream primer in the first general area and the first area of complementary components; the 3 'end of the first complementary region and the first general area of the connection, the first complementary region and the first complete complementary sequence; the first sequence for a the observed sequence of SNP loci in the sequence at the 3' end of the measured SNP sites, the first sequence from the 5 'end of the sample SNP loci from 1 to 7bp; the first general area with second complementary sequence; the second sequence is detected SNP loci and the sequence of a sequence the 3' end connected to a sequence. The invention can avoid the inaccuracy of the sequencing result or the failure of the sequencing result because of the particularity of the sequence near the SNP site to be measured.

【技术实现步骤摘要】
引物组、锚定引物、试剂盒、文库构建及基因测序方法
本专利技术涉及分子生物学领域，更具体地说，涉及一种引物组、锚定引物、文库构建方法及基因测序方法。
技术介绍
第二代高通量测序技术包括连接测序法和合成测序法。其中，所述连接测序法是基于连接酶在核酸片段之间进行连接反应的过程中的保真性来实现的，以待测序核酸片段为模板，锚定引物（又称测序引物，其与待测序核酸片段所在链互补）和寡核苷酸探针（该探针的特定位置上带有荧光标记）进行连接反应，通过检测连接产物上的荧光标记从而确定寡核苷酸探针上带有荧光标记的特定位置对应的序列的信息。所述合成测序法是基于聚合酶在延伸核酸链过程中的保真性来实现的，以待测序核酸片段为模板，锚定引物互补结合至待测序核酸片段上，通过检测在延伸过程中产生的信号来确定待测序核酸片段上相应位置的序列信息。第二代高通量测序技术因为其高通量和低成本，目前用于SNP分型检测。现有技术中的一种利用第二代高通量测序技术的SNP分型方法，包括以下步骤：A、通过引物扩增获得待测SNP位点的核酸序列；B、基于步骤A的产物构建测序文库；C、将锚定引物锚定在测序文库分子上，通过高通量测序技术检测待测SNP位点的序列信息。为了加快待测SNP位点的检测，减少测序的循环数，提高SNP位点检测效率，一般将锚定引物设计在待测SNP位点的附近。但是这种设计方法，往往会因为SNP位点所在序列的特殊性，例如该SNP位点附近序列存在特殊结构——重复序列、发夹情况等，导致按照上述方法设计的锚定引物，无法准确的锚定在预定位置，造成测序结果不准确或测序失败；使得该方法无法大规模推广。因此需要一种新的适用范围广的引物组、锚定引物、试剂盒、文库构建及基因测序方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新的适用范围广的引物组、锚定引物、试剂盒、文库构建及基因测序方法，旨在解决现有的高通量基因测序技术中锚定引物的非特异性锚定的技术问题。为了实现专利技术目的，本专利技术提供了一种引物组，包括第一引物对，所述第一引物对中的上游引物由第一通用区和第一互补区组成；所述第一互补区与所述第一通用区的3’末端连接，所述第一互补区与第一序列完全互补；所述第一序列为待测SNP位点所在序列中的一段序列，处于待测SNP位点的3’端，所述第一序列的5’末端距待测SNP位点1至7bp；所述第一通用区不与第二序列互补；所述第二序列为待测SNP位点所在序列上与第一序列的3’末端连接的一段序列。优选的，所述第一互补区序列长度在6至12bp之间。优选的，所述第一通用区序列长度在6至16bp之间。优选的，所述第一序列的5’末端距待测SNP位点1至3bp。优选的，所述引物组还包括第二引物对，所述第一引物对和第二引物对分别为对待测SNP位点所在序列进行扩增的内引物对和外引物对。优选的，所述第一引物对中的下游引物由第二通用区和第二互补区组成；所述第二互补区与所述第二通用区的3’末端连接；所述第二互补区为待测SNP位点所在序列中的一段序列，处于待测SNP位点的5’端；所述第二通用区与第三序列不同；所述第三序列为待测SNP位点所在序列上与第二互补区的5’末端连接的一段序列。优选的，所述第一通用区中含有U。为了更好的实现本专利技术的目的，本专利技术还提供了一种锚定引物，所述锚定引物与第四序列完全互补配对；所述第四序列为单链核酸分子，是上述任一种引物组中的第一引物对的扩增产物中的一段序列；所述第四序列包括第一序列和第一归一化区，所述第一归一化区与第一序列的3’末端连接，所述第四序列的5’末端距待测SNP位点1至7bp；或所述第四序列包括第一互补区和第二归一化区，所述第二归一化区与第一互补区的5’末端连接，所述第四序列的3’末端距待测SNP位点1至7bp。优选的，所述第四序列包括第一序列和第一归一化区，所述第一归一化区与第一序列的3’末端连接，所述第一序列的5’末端距待测SNP位点1至3bp；或所述第四序列包括第一互补区和第二归一化区，所述第二归一化区与第一互补区的5’末端连接，所述第四序列的3’末端距待测SNP位点1至3bp。优选的，所述第一互补区序列长度在6至12bp之间。优选的，所述第一归一化区的长度在8至14bp之间。为了更好的实现本专利技术的目的，本专利技术还提供了一种试剂盒，包括上述的任一种引物组。优选的，所述试剂盒还包括上述的任一种锚定引物。为了更好的实现本专利技术的目的，本专利技术还提供了另一种试剂盒，包括上述的任一种锚定引物。优选的，所述试剂盒还包括上述的任一种引物组。为了更好的实现本专利技术的目的，本专利技术还提供了一种文库构建方法，包括以下步骤：A、利用上述的任一种引物组，对待测样本进行PCR扩增，得含待测SNP位点的扩增产物；B、将含待测SNP位点的扩增产物与接头连接，形成待测序文库分子。优选的，所述步骤B为：将含待测SNP位点的扩增产物直接与接头连接，形成待测序文库分子，并通过微球可寻址的固定在固相载体上。更优选的，所述步骤B包括以下步骤：B1、将含待测SNP位点的扩增产物直接与固定在微球上的接头连接，形成固定在微球上的待测序文库分子；B2、将步骤B1所得微球可寻址的固定在固相载体上。更优选的，所述步骤B1中的连接反应是在切割-连接反应体系中进行的，所述切割-连接反应体系包括：连接酶、断裂剂、固定在微球上的第一接头和连接缓冲液；所述第一通用区中含有U；所述断裂剂用于特异性切割U，并使含待测SNP位点的扩增产物形成第一粘性末端；所述第一接头为核酸分子，含有与第一粘性末端完全互补配对的第二粘性末端。更优选的，步骤B1中所述连接缓冲液中含有PEG。为了更好的实现本专利技术的目的，本专利技术还提供了一种基因测序方法，包括以下步骤：A、利用上述的任一种引物组，对待测样本进行PCR扩增，得含待测SNP位点的扩增产物；B、将含待测SNP位点的扩增产物与接头连接，形成待测序文库分子；C、利用上述的任一种锚定引物，对待测序文库分子进行测序，获得待测SNP位点的序列信息。优选的，所述步骤C中的测序方法为连接测序法；所述步骤B、C之间还包括步骤D，采用上述任一种锚定引物，利用无荧光标记的寡核苷酸探针替换有荧光标记的寡核苷酸探针，对待测序文库分子进行一次连接测序反应。优选的，所述步骤D包括以下步骤：D1、将所述锚定引物锚定在待测序文库分子上；D2、加入无荧光标记的寡核苷酸探针、连接酶以及相应的缓冲液，进行连接反应；D3、变性去除连接产物。由上可知，本专利技术通过对待测SNP位点的扩增引物进行特殊设计，使得通过该扩增引物扩增的产物中的待测SNP位点附近均包括第一通用区，降低不同待测SNP位点附近区域的复杂度，然后基于第一通用区与待测SNP位点之间的序列，可设计相应的锚定引物，使锚定引物准确的锚定在目标位置，本专利技术的引物组、锚定引物、试剂盒、文库构建及基因测序方法适用于多种不同的SNP位点的检测，尤其适用于多SNP位点的同时检测，能在保证SNP位点检测效率的前提下，避免因为待测SNP位点附近序列的特殊性而导致的测序结果不准确或测序失败现象的出现。附图说明图1是本专利技术第一典型实施例中第一引物对中的上游引物与待测SNP位点所在序列之间的关系示意图。图2是本专利技术一实施例中第一引物对中的下游引物与待测SNP位点所在序列之间的关系示意图。图3是本专利技术第二典型本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种引物组，包括第一引物对，其特征在于，所述第一引物对中的上游引物由第一通用区和第一互补区组成；所述第一互补区与所述第一通用区的3’末端连接，所述第一互补区与第一序列完全互补；所述第一序列为待测SNP位点所在序列中的一段序列，处于待测SNP位点的3’端，所述第一序列的5’末端距待测SNP位点1至7bp；所述第一通用区不与第二序列互补；所述第二序列为待测SNP位点所在序列上与第一序列的3’末端连接的一段序列。

【技术特征摘要】
1.一种引物组，包括第一引物对，其特征在于，所述第一引物对中的上游引物由第一通用区和第一互补区组成；所述第一互补区与所述第一通用区的3’末端连接，所述第一互补区与第一序列完全互补；所述第一序列为待测SNP位点所在序列中的一段序列，处于待测SNP位点的3’端，所述第一序列的5’末端距待测SNP位点1至7bp；所述第一通用区不与第二序列互补；所述第二序列为待测SNP位点所在序列上与第一序列的3’末端连接的一段序列。2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述第一互补区序列长度在6至12bp之间。3.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述第一通用区序列长度在6至16bp之间。4.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物组还包括第二引物对，所述第一引物对和第二引物对分别为对待测SNP位点所在序列进行扩增的内引物对和外引物对。5.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述第一引物对中的下游引物由第二通用区和第二互补区组成；所述第二互补区与所述第二通用区的3’末端连接；所述第二互补区为待测SNP位点所在序列中的一段序列，处于待测SNP位点的5’端；所述第二通用区与第三序列不同；所述第三序列为待测SNP位点所在序列上与第二互补区的5’末端连接的一段序列。6.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述第一通用区中含有U。7.一种锚定引物，其特征在于，所述锚定引物与第四序列完全互补配对；所述第四序列为单链核酸分子，是权利要求1至6中任一种引物组中的第一引物对的扩增产物中的一段序列；所述第四序列包括第一序列和第一归一化区，所述第一归一化区与第一序列的3’末端连接，所述第四序列的5’末端距待测SNP位点1至7bp；或所述第四序列包括第一互补区和第二归一化区，所述第二归一化区与第一互补区的5’末端连接，所述第四序列的3’末端距待测SNP位点1至7bp。8.根据权利要求7所述的锚定引物，其特征在于，所述第一互补区序列长度在6至12bp之间。9.根据权利要求7所述的锚定引物，其特征在于，所述第一归一化区的长度在8至14bp之间。10.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1至6中的任一种引物组。11.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求7...

【专利技术属性】
技术研发人员：盛司潼，钟茂春，
申请(专利权)人：盛司潼，
类型：发明
国别省市：广东,44