用于测序测定的通用对照制造技术

本发明专利技术涉及分别用于测序测定的阳性和阴性对照以及提取对照。本申请公开了质粒、试剂盒、它们的用途以及检测特定核酸的方法，其中使用了根据本发明专利技术的对照。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于测序测定的通用对照，其可以分别用作阳性和阴性对照以及提取对照。本专利技术申请描述了相应的质粒、试剂盒、它们的用途以及使用本专利技术对照检测特定核酸的方法。
技术介绍
核酸测序的使用已成为现代医学的多种诊断领域中的必需工具。该领域的实例为肿瘤学，其中使用核酸测序以鉴定(例如)致癌突变是否存在于基因中或者引起和/或指明癌症的移位是否存在于基因组中。此外，使用核酸测序来检测病原微生物(如，例如，细菌或病毒)是否存在于来自人患者的临床样品，如(例如)组织样品或血液样品中。在后一种方法中，检测不存在于人受试者中，而仅存在于微生物中的核酸序列。通常，在实际测序步骤之前是扩增反应，以扩增待测序的核酸。这种扩增反应通常通过PCR反应进行；因此，在PCR反应中使用杂交至待扩增序列的上游和下游的序列的特异性引物(即引物与待扩增序列侧接)。由于过去几十年的进步，诊断方法过程中的很多步骤已自动化。这种步骤的实例为从临床样品提取核酸。因此，现在有可能提供几乎如从患者采集状态的临床样品并尤其以充分自动化的方式实施提取步骤。考虑到上述情况，典型的诊断测定可以涉及回答特定病原体是否存在于来自人受试者的临床样品(例如，来源于呼吸道的样品)中的问题。针对该目标，从人受试者采集临床样品(如，例如，痰液)，其中该步骤是在尽可能无菌的条件下进行的。然后，将样品转移到反应小瓶中，其通常是多个小瓶系统的一部分，如，例如，36个小瓶的样品环。当然，还可以平行分析来自其它患者的其它临床样品。然后，将来自这些样品的核酸尤其以自动化方式提取。在下一个自动化步骤中，在小瓶中进行PCR反应，其中使用了特异性引物，导致靶标序列
的扩增，所述靶标序列仅存在于病原体中并且特征在于待检测的特定病原体。在下一步中，然后对扩增的核酸测序以鉴定靶标序列。所述测定可以导致鉴定靶标序列，这将表明临床样品中存在病原体，或者未检测到靶标序列，这将表明临床样品中不存在病原体。然而，在如上所述的测定中不能排除不正确地进行了所述测定的某些步骤。不正确地进行的测定的典型实例是由于未正确进行提取步骤而未检测到靶标序列。因此，病原体可能的确存在于样品中，尽管结果为阴性(“假阴性”结果)。为了排除不正确的提取步骤，通常进行提取对照；提取对照通常对应于具有不同于待检测序列的序列的核酸。通常，在开始自动提取步骤之前将该核酸添加(“加标”)到样品中(通常，通过在提取期间将该核酸加入到所使用的裂解缓冲液中)。由于该核酸的序列不同于待检测序列，因此在扩增反应期间使用第二对引物以扩增提取对照序列。测定完成后，提取对照序列的存在表明提取步骤确实正确进行。因此，提取对照需要另外一对引物，从而具有与用于靶标扩增的引物交叉反应的风险并且提高了成本。还需确保扩增靶标序列的PCR反应在所应用的条件下进行。针对该目标，应用阳性对照；所述阳性对照通常由确切具有待扩增病毒序列的质粒组成，其包括侧接该序列的区域，所述区域与用于样品扩增反应的引物杂交的序列相同。如果使用用于样品的试剂和条件可以在该阳性对照中检测到序列，则扩增反应确实正确工作。然而，为了确保具有阳性对照或病原体的所有样品无污染，则需要进行阴性对照。阴性对照反应通常在单独的小瓶中进行，其中仅向该特定小瓶中加入缓冲液而不是样品。阴性对照中靶标序列的存在表明样品被污染。因此，需要进行需要材料和空间的额外对照反应来作为阴性对照。综上所述，目前在检测测定中使用的对照需要额外的空间和材料并且提高了交叉反应的可能性。因此，需要改善诊断测序测定中使用的实验对照。专利技术的目标和内容因此，本专利技术提供了检测样品中包含靶标序列的核酸的存在的新方法、质粒、所述质粒的用途和用于样品中包含靶标序列的核酸的检测的试剂盒。在第一个方面，本专利技术涉及检测样品中包含靶标序列(T)的核酸的存在的体外方法，其中所述方法包括以下步骤：a)提供可能包含含有T的核酸的样品，其中T侧接杂交至正向引物(FOR)的序列和杂交至反向引物(REV)的序列；b)将所述样品转移到小瓶V1；c)提供包含对照序列1(S1)的质粒，其中S1侧接杂交至FOR的序列和杂交至REV的序列，其中T和S1不相同；d)将步骤c)的所述质粒转移到小瓶V2；e)提供包含对照序列2(S2)的质粒，其中S2侧接杂交至FOR的序列和杂交至REV的序列，其中T、S1和S2不相同；f)将步骤e)的所述质粒转移到所述小瓶；g)提取所述小瓶中的核酸；h)使用引物FOR和REV在所述小瓶中进行PCR反应；i)对在所述小瓶中扩增的核酸测序；其中如果小瓶V2中测序结果是S1和S2的存在并且如果小瓶V1中测序结果是T和S2的存在，则小瓶V1中T的存在表明所述样品中所述含有T的核酸的存在。需要理解上述测序结果以排他的方式表示，即，未鉴定到其它序列；因此，以上段落还可以如下拟定：其中如果小瓶V2中测序结果仅两个序列，即S1和S2的存在，并且如果小瓶V1中的测序结果仅两个序列，即T和S2的存在，则小瓶V1中T的存在表明所述样品中所述包含T的核酸的存在。如果在核酸中检测到了几个靶标序列，则小瓶V1中的测序结果是这些几个靶标序列和S2的存在。在优选的实施方式中，所述样品为临床样品，其中所述临床样品优选地来自人受试者。优选地，所述临床样品是组织样品或体液样品。所述样品可以(例如)是从呼吸道、胃肠道或移植后的移植物获得的组织样品。此外，所述样品可以具体地为体液样品，其选自血液、血浆、血清、淋巴液和唾液。在另一个优选的实施方式中，所述包含T的核酸是来自微生物的核酸。优选地，所述微生物选自细菌、古细菌、原生动物、真菌和病毒。在特别优选的实施方式中，所述微生物为细菌，其选自A群链球菌，包括结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、非洲分枝杆菌(Mycobacterium africanum)、牛型结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、卡氏分枝杆菌(Mycobacterium canetti)和田鼠分枝杆菌(Mycobacterium microti)的结核分枝杆菌复合群成员，肠沙门氏菌种(Salmonella enterica spp.)，艰难梭菌(Clostridium difficile)，万古霉素耐受性肠球菌(Vancomycin-resistant enterococcus)和二甲氧苯青霉素耐受性金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus)。在另一个特别优选的实施方式中，所述微生物是病毒，其选自腺病毒、禽流感A(H7N9)病毒、中东呼吸综合征冠状病毒、诺瓦克病毒、BK病毒、巨细胞病毒、埃-巴二氏病毒、单纯疱疹病毒1、单纯疱疹病毒2、水痘-带状疱疹病毒、肠道病毒、人类免疫缺陷性病毒(HIV)，具体地，HIV-1、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、登革热病毒和基孔肯亚病毒。在最优选的实施方式中，所述微生物是选自HIV(具体地，HIV-1)、HBV和HCV的病毒。在特定物种内，可以选择和检测微生物不同的基因型，如(例如)诺瓦克病毒的GI和Gil基因型；HIV的亚型A至K；HBV的基因型A至H和HCV的基因型1至4。在特别优选的实施方本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测样品中包含靶标序列(T)的核酸的存在的体外方法，其包括以下步骤：a)提供可能包含含有T的核酸的样品，其中T侧接杂交至正向引物(FOR)的序列和杂交至反向引物(REV)的序列；b)将所述样品转移到小瓶V1；c)提供包含对照序列1(S1)的质粒，其中S1侧接杂交至FOR的序列和杂交至REV的序列，其中T和S1不相同；d)将步骤c)的所述质粒转移到小瓶V2；e)提供包含对照序列2(S2)的质粒，其中S2侧接杂交至FOR的序列和杂交至REV的序列，其中T、S1和S2不相同；f)将步骤e)的所述质粒转移到所述小瓶；g)提取所述小瓶中的核酸；h)使用引物FOR和REV在所述小瓶中进行PCR反应；i)对在所述小瓶中扩增的核酸测序；其中如果小瓶V2中测序结果是S1和S2的存在并且如果小瓶V1中测序结果是T和S2的存在，则小瓶V1中T的存在表明所述样品中所述含有T的核酸的存在。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.04.10 GB 1406485.11.检测样品中包含靶标序列(T)的核酸的存在的体外方法，其包括以下步骤：a)提供可能包含含有T的核酸的样品，其中T侧接杂交至正向引物(FOR)的序列和杂交至反向引物(REV)的序列；b)将所述样品转移到小瓶V1；c)提供包含对照序列1(S1)的质粒，其中S1侧接杂交至FOR的序列和杂交至REV的序列，其中T和S1不相同；d)将步骤c)的所述质粒转移到小瓶V2；e)提供包含对照序列2(S2)的质粒，其中S2侧接杂交至FOR的序列和杂交至REV的序列，其中T、S1和S2不相同；f)将步骤e)的所述质粒转移到所述小瓶；g)提取所述小瓶中的核酸；h)使用引物FOR和REV在所述小瓶中进行PCR反应；i)对在所述小瓶中扩增的核酸测序；其中如果小瓶V2中测序结果是S1和S2的存在并且如果小瓶V1中测序结果是T和S2的存在，则小瓶V1中T的存在表明所述样品中所述含有T的核酸的存在。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品为临床样品。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述临床样品为组织样品或体液样品，优选地来自人受试者。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述包含T的核酸为来自微生物的核酸。5.根据权利要求3所述的方法，其中所述微生物选自细菌、古细菌、原生动物、真菌和病毒。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述包含T的核酸为致癌基因，优选地，人致癌基因。7.包含对照序列(S)的质粒，其中S侧接杂交至正向引物(FOR)的序列和杂交至反向引物(REV)的序列，其中所述杂交至FOR和...

【专利技术属性】
技术研发人员：李·查理·华恒，普哈米拉·卢旺特·阿里亚特，
申请(专利权)人：贝拉医疗私人贸易有限公司，
类型：发明
国别省市：新加坡;SG