本发明专利技术涉及一种涉及47种基因的PCR引物以及标签PCR引物，所述标签PCR引物由PCR引物以及连接于PCR引物对中至少一条引物5’端的DNA标签序列组成，所述DNA标签序列选自SEQ ID NO:107—SEQ ID NO:126。本发明专利技术还涉及应用所述由标签PCR引物的DNA标签构建测序文库的方法和试剂盒。本发明专利技术所提供的检测方法与测序法的吻合率高达100％，所提供的扩增引物与DNA标签形成一个特异性、灵敏度和重复性之间达到优化、平衡的检测产品，能并行检测体细胞突变与单核苷酸多态性，一次检测能够准确区分1-20种样本来源的多条碱基序列。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及构建基因突变 测序文库的引物和方法以及试剂盒。 技术背景 基因突变是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变。常见的基因突变 有体细胞突变和单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP) 〇 体细胞突变是发生在正常机体细胞中的突变，比如发生在皮肤或器官中的突变。 近年来，癌症基因组的研宄发现，癌变过程中与之相关的体细胞突变位点有成千上万处。但 是，目前癌症的诊疗却往往会忽视这一点。临床上的治疗策略主要针对数目占优的突变体 细胞。以治疗乳腺癌的单抗药物赫赛汀（Herceptin)为例，它的作用靶点是癌细胞过度表 达的HER2基因。倘若患者体内的癌细胞中，存在不含HER2基因亚克隆，即便赫赛汀使用之 初有效，随着此种癌细胞进化、增殖，同样会导致癌症恶化或复发。这也就解释了，为什么相 同的治疗方案，面对不同的患者会有不同的疗效。治愈的癌症患者又存在病情复发的可能。 目前与肿瘤的发生、发展或药物疗效相关的体细胞突变主要有：AKT1、AKT3、APC、ATM、BARF、 CDHl、CDKN2A、CTNNBI、EGFR、FGFRl、FGFR2、FGFR3、FLT3、HER2、HRAS、IDHl、IDH2、KIT、KRAS、 MEKl、MET、NRAS、PDGFRA、PIK3CA、PIK3R1、PIK3R5、PTEN、PTPNl 1、RBl、STKll、TP53、TSCl、 VHL 等。 SNP在人群中的发生频率大于1%，包括单碱基的转换、颠换以及单碱基的插入或 缺失等表现形式。它是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90%以上， 是人种之间、个体之间差异的遗传物质基础之一。SNP作为一种遗传标记得到广泛应用，主 要源于以下几个特性：（1)密度高：SNP在人类基因组平均密度估计为500~lOOObp，在整 个基因组的分布达300万个以上，遗传距离为2~3cm，其密度比微卫星标记高出几个数量 级，可以在任何待研宄基因的内部或附近提供一系列标记。（2)代表性：某些SNP可能在转 录、翻译、拼接以及RNA稳定性等方面发挥重要作用，而某些位于基因内部的SNP有可能直 接影响蛋白质结构或者表达水平，因此它们可能代表疾病遗传机制中的某些作用因素。（3) 遗传稳定性：SNP来源于数千年前发生的突变，随着人类世代繁衍稳定地遗传至今，和微卫 星等重复序列多态标记相比，SNP具有更高的遗传稳定性。具备以上优点，SNP被认为是继 第一代限制性片断长度多态性和第二代微卫星多态性之后的第三代分子遗传标记。目前与 肿瘤的发生、发展相关的 SNP 主要有：CYP2D6、DPYD、TYMS、UGT1A1、VEGFA、VEGFR2、VEGFR3、 CYP3A5、TPMT、MTHFR、GSTP1、ERCC1、ERCC2 以及 XRCCl 等。 目前已有多种方法可用于基因突变检测，如测序法、DHPLC法、ARMS法、生物芯片 等。其中第一代测序技术、ARMS、DHPLC等方法无法实现多个靶标基因并行检测而只能分 开多次进行，从而导致使用样本量成倍递增、增加系统误差、检测过程耗时且费用昂贵等问 题，使其难以实现规模化。液相芯片检测方法虽然能实现多个基因的并行检测，但是对未知 的突变位点具有一定的局限性。 多基因并行检测，不仅增加效率，降低费用，其更为重要的作用是提高检测敏感度 和临床敏感度，对基因突变的检测对肿瘤的早筛以及临床个体化治疗有着重要的指导意 义。目前，基于多重PCR的多基因并行检测，未能很好解决以下问题：引物内部形成发卡结 构或二聚体等二级结构；所设计的引物之间存在非特异性结合，与DNA标签组合形成的标 签引物之间形成二聚体、存在错配、与PCR产物之间均存在非特异性结合等。 第二代测序的基本原理是边合成边测序。在Sanger等测序方法的基础上，用不同 颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放 出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的 序列信息。二代测序是一项新的低成本，高通量，高准确度的快速测序技术，在临床和科学 研宄方面都有着广泛的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种PCR引物，该PCR引物可与DNA标签连接构成标签 扩增引物，通过PCR扩增使PCR产物带上相应的DNA标签，并通过将多个不同样品来源的带 有不同DNA标签的PCR产物混合成一个文库，从而实现高通量测序。 实现上述目的的技术方案如下。 一种PCR引物，选自于以下至少一对针对目标基因突变位点设计的引物序列：针 对AKTl基因的SEQ ID N0:1 和SEQ ID N0:2,针对AKT3基因的SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4， 针对APC基因的 SEQ ID N0:5 和 SEQ ID N0:6，SEQ ID N0:7 和 SEQ ID N0:8,针对 ATM基因 的 SEQ ID N0:9和 SEQ ID N0:10,针对BRAF基因的 SEQ ID N0:11 和 SEQ ID N0:12，SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14,针对 CDHl 基因的 SEQ ID NO: 15 和 SEQ ID NO: 16,针对 CDKN2A 基 因的 SEQ ID NO: 17 和 SEQ ID NO: 18,针对 CTNNBl 基因的 SEQ ID NO: 19 和 SEQ ID NO: 20， 针对 CYP2D6 基因的 SEQ ID NO: 21 和 SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 和 SEQ ID NO: 24,针对 CYP3A5 基因的 SEQ ID NO: 25 和 SEQ ID NO: 26,针对 DPYD 基因的 SEQ ID NO: 27 和 SEQ ID NO: 28,针对 EGFR 基因的 SEQ ID NO: 29 和 SEQ ID NO: 30,针对 ERCCl 基因的 SEQ ID NO: 31 和 SEQ ID NO: 32,针对 ERCC2 基因的 SEQ ID NO: 33 和 SEQ ID NO: 34,针对 FGFRl 基因的 SEQ ID NO: 35 和 SEQ ID NO: 36,针对 FGFR2 基因的 SEQ ID NO: 37 和 SEQ ID NO: 38,针对 FGFR3 基因的 SEQ ID NO: 39 和 SEQ ID NO:40,针对 FLT3 基因的 SEQ ID NO:41 和 SEQ ID N0:42,针对GSTPl基因的SEQ ID N0:43和SEQ ID N0:44,针对HER2基因的SEQ ID N0:45和 SEQ ID NO: 46,针对 HRAS 基因的 SEQ ID NO: 47 和 SEQ ID NO: 48,针对 IDHl 基因的 SEQ ID NO: 49 和 SEQ ID NO: 50,针对 IDH2 基因的 SEQ ID NO: 51 和 SEQ ID NO: 52,针对 KIT 基因的 SE本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种PCR引物，其特征是，选自于以下至少一对针对目标基因突变位点设计的引物序列：针对AKT1基因的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，针对AKT3基因的SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，针对APC基因的SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，针对ATM基因的SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10，针对BRAF基因的SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14，针对CDH1基因的SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16，针对CDKN2A基因的SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18，针对CTNNB1基因的SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20，针对CYP2D6基因的SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24，针对CYP3A5基因的SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26，针对DPYD基因的SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28，针对EGFR基因的SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30，针对ERCC1基因的SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32，针对ERCC2基因的SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34，针对FGFR1基因的SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36，针对FGFR2基因的SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38，针对FGFR3基因的SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40，针对FLT3基因的SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42，针对GSTP1基因的SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44，针对HER2基因的SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46，针对HRAS基因的SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48，针对IDH1基因的SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50，针对IDH2基因的SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:52，针对KIT基因的SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54，针对KRAS基因的SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56，SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58，针对MEK1基因的SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:60，针对MET基因的SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:62，针对MTHFR基因的SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64，SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66，针对NRAS基因的SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:68，针对PDGFRA基因的SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:70，针对PIK3CA基因的SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:72，针对PIK3R1基因的SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:74，针对PIK3R5基因的SEQ ID NO:75和SEQ ID NO:76，针对PTEN基因的SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:78，针对PTPN11基因的SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:80，针对RB1基因的SEQ ID NO:81和SEQ ID NO:82，针对STK11基因的SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:84，SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:86，针对TP53基因的SEQ ID NO:87和SEQ ID NO:88，针对TPMT基因的SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:90，针对TSC1基因的SEQ ID NO:91和SEQ ID NO:92，针对TYMS基因的SEQ ID NO:93和SEQ ID NO:94，针对UGT1A1基因的SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:96，针对VEGFA基因的SEQ ID NO:97和SEQ ID NO:98，针对VEGFR2基因的SEQ ID NO:99和SEQ ID NO:100，针对VEGFR3基因的SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:102，针对VHL基因的SEQ ID NO:103和SEQ ID NO:104，针对XRCC1基因的SEQ ID NO:105和SEQ ID NO:106。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘志明，吴诗扬，廖传荣，
申请(专利权)人：益善生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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