从粪便中提取富集人源DNA的方法技术

本发明专利技术公开了一种从粪便中提取富集人源DNA的方法，包括样本裂解与杂质净化、核酸吸附与洗脱、目标人源DNA富集三个步骤，本发明专利技术的方法可以去除粪便样本中大量存在的多糖、蛋白质、色素和多酚等杂质，提高硅胶膜柱处理待结合DNA溶液的效率，极大地提高DNA的纯化得率，尤其是短片段DNA的纯化得率，富集得到的特定人源DNA不含有抑制PCR产物的物质，可以直接应用于PCR扩增检测。且可以一次杂交，分类富集目标人源DNA片段的目的，提升了目标核酸序列捕获的灵活性。获的灵活性。获的灵活性。

【技术实现步骤摘要】
从粪便中提取富集人源DNA的方法


[0001]本专利技术属于生物学领域，更具体地，本专利技术涉及一种从粪便中提取富集人源DNA的方法。

技术介绍

[0002]结直肠癌也称大肠癌，包括直肠癌和结肠癌，是常见的恶性肿瘤之一。超过80％的患者被确诊时，已经处于中晚期，早癌发现率<15％。结直肠癌的预后与早发现、早诊断、早治疗密切相关，早期结直肠癌5年生存率可达90％以上，极早癌几乎可100％治愈，而晚期的5年生存率不足10％。因此结直肠癌的早筛对提升结直肠癌的治愈效果有着重要作用。
[0003]目前结直肠癌的筛查手段主要有粪便潜血试验和肠镜检查，粪便潜血试验的优点是无创方便，但缺点是敏感度低(79％)。肠镜检查是结直肠癌筛查的金标准，但是前期受试者需要进行肠道准备，过程漫长而且还会给受试者造成不适，肠镜检查意愿低。
[0004]每天大概有10
10
个肠道上皮细胞脱落进入粪便里面，这些细胞含有的基因信息可作为基因检测的样本。因此近年来，出现了一种通过检测检测肠道上皮细胞DNA异常状态(基因序列异常甲基化和基因突变)来筛查结直肠癌的方法，该方法与粪便潜血试验一样，是无创筛查方法，但是敏感度(大于85％)比粪便潜血试验高。
[0005]然而这些上皮细胞DNA与粪便内多种杂质混合在一起，且处于大量微生物基因组DNA的背景下，粪便样本中99.99％的DNA都来源于细菌和食物，只有0.01％来源于人体脱落的肠道上皮和肿瘤细胞。想要提取到满足检测要求的DNA，会面临以下难题：1、需要处理数克的粪便样本，提高人源DNA的得率，尽量获得更多的人源DNA。2、需要去除粪便中各种杂质，避免干扰DNA的下游检测。3、需要去除非人源背景DNA，提高人源DNA的含量，有利于提升下游检测灵敏度。
[0006]因此，开发一种从粪便中提取并富集可以满足检测要求的人源DNA的方法非常有意义。

技术实现思路

[0007]基于此，本专利技术的目的之一在于提供一种从粪便中提取富集人源DNA的方法，采用所述方法可以有效去除粪便中的杂质，提高DNA(尤其是短片段DNA)的提取得率和纯化得率，所得目标人源DNA可以满足检测要求。
[0008]实现上述专利技术目的的具体技术方案包括如下：
[0009]一种从粪便中提取富集人源DNA的方法，包括以下步骤：
[0010](1)、使用粪便匀浆液和蛋白酶K溶液，充分分散粪便样本；离心取上清液，加入上清液1/10～1/8体积的除杂液A，混匀后静置；离心取上清液，加入上清液1/50～1/40体积的除杂液B，混匀后静置；离心收集上清液，即得除杂DNA溶液；
[0011]其中，所述除杂液A为60mg～80mg/mL的Ca(OH)2悬液；所述除杂液B为含0.1％～0.3％壳聚糖的醋酸溶液；
[0012](2)、在步骤(1)得到的除杂DNA溶液中加入1倍～2倍体积的结合缓冲液，混匀后加入至装有硅胶膜柱的离心管中，离心后弃离心管中的液体；加入洗涤液A，静置后离心，弃去离心管中的液体；加入预热至70～80℃的洗脱液A，静置后离心，即得纯化的DNA溶液；
[0013]所述结合缓冲液包括：4M～5M异硫氰酸胍或盐酸胍，25％～35％异丙醇，0.1％～0.5％Pluronic F
‑
68，pH 5～5.2；
[0014](3)、富集步骤(2)中所述纯化的DNA溶液中的目标人源DNA。
[0015]在其中一些实施例中，步骤(2)中所述硅胶膜柱的容积为20mL～22mL，硅胶膜柱的硅胶模直径为25mm～26mm，厚度为3mm～4mm。
[0016]在其中一些实施例中，步骤(1)中所述除杂液A为65mg～75mg/mL的Ca(OH)2悬液；所述除杂液B为含0.15％～0.25％壳聚糖的醋酸溶液。
[0017]在其中一些实施例中，步骤(3)中所述富集目标人源DNA包括以下步骤：向纯化的DNA溶液中加入杂交缓冲液，以及与目标人源DNA片段序列互补配对的捕获探针混合液，加热变性后杂交；加入磁珠悬液震荡孵育；静置后去除上清；加入洗涤液B重悬磁珠，静置后去除上清；加入释放缓冲液，90℃～98℃加热变性5～10min后，冰上静置；吸取上清，即为富集的目标人源DNA。
[0018]在其中一些实施例中，所述捕获探针混合液包括N条针对目标人源DNA的捕获探针，每条所述捕获探针的浓度为1～10pmol/ul，每条所述捕获探针的5'端包括标签核酸序列，所述N为正整数。
[0019]在其中一些实施例中，所述磁珠悬液中磁珠的浓度为8mg/mL～12mg/mL，磁珠的直径为0.5～2微米；所述磁珠上偶联有标签捕获序列，所述标签捕获序列与所述捕获探针的标签核酸序列互补。
[0020]在其中一些实施例中，所述加热变性为80℃～90℃，10～20min；所述杂交为37～52℃，2h～3h；所述震荡孵育为37～42℃，0.5～1h。
[0021]在其中一些实施例中，所述杂交缓冲液包括：2
×
～3
×
SSC，18％～22％硫酸葡聚糖，0.1～0.5mM EDTA，50～60％去离子甲酰胺；和/或，所述洗涤液B包括：10mM～50mM Tris，100mM～500mM EDTA，0.5～1.5M NaCl，0.1％～0.5％Tween
‑
20；和/或，所述释放缓冲液包括：10～20mM Tris，0～0.1mM EDTA，5～10ng/uLCarrier RNA。
[0022]在其中一些实施例中，步骤(2)中所述离心为4000
×
g离心2～3min。
[0023]在其中一些实施例中，步骤(2)中所述洗涤液A包括：5～10mM Tris，80～85％乙醇，pH7.4～7.6；和/或，所述洗脱液A包括：5～10mM Tris，0.1mM EDTA，pH8.0～8.5。
[0024]在其中一些实施例中，步骤(1)中所述粪便匀浆液包括：2％～4％(w/v)CTAB、3M～4MNaCl、20mM～40mM EDTA、50mM～100mM Tris、1％～3％PVP10；和/或，所述蛋白酶K溶液的浓度为20mg/mL～40mg/mL。
[0025]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0026]1、在本专利技术中，通过使用Ca(OH)2悬液和含壳聚糖的醋酸溶液作为粪便DNA提取过程中的除杂液，再配合使用特殊配方的结合缓冲液和硅胶膜柱(大面积大容积)对粪便DNA进行吸附纯化，最后再富集目标人源DNA，在此构思下，本专利技术的方法可以去除粪便样本中大量存在的多糖、蛋白质、色素和多酚等杂质，提高硅胶膜柱处理待结合DNA溶液的效率，极大地提高DNA的纯化得率，尤其是短片段DNA的纯化得率，提取得到的目标人源DNA不含有抑
制PCR产物的物质，可以直接应用于PCR扩增检测。
[0027]2、相对于常规采用的生物素标记的捕获探针，本专利技术的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种从粪便中提取富集人源DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)、使用粪便匀浆液和蛋白酶K溶液，充分分散粪便样本；离心取上清液，加入上清液1/10～1/8体积的除杂液A，静置离心取上清液，加入上清液1/50～1/40体积的除杂液B，静置离心，收集上清液，即得除杂DNA溶液；其中，所述除杂液A为60mg～80mg/mL的Ca(OH)2悬液；所述除杂液B为含0.1％～0.3％壳聚糖的醋酸溶液；(2)、在步骤(1)得到的除杂DNA溶液中加入1倍～2倍体积的结合缓冲液，再加入至装有硅胶膜柱的离心管中，离心后弃离心管中的液体；加入洗涤液A，静置后离心，弃去离心管中的液体；加入预热至70℃～80℃的洗脱液A，静置后离心，即得纯化的DNA溶液；其中，所述结合缓冲液包括：4M～5M异硫氰酸胍或盐酸胍，25％～35％异丙醇，0.1％～0.5％Pluronic F
‑
68，pH 5～5.2；(3)、富集步骤(2)纯化的DNA溶液中的目标人源DNA。2.根据权利要求1所述的从粪便中提取富集人源DNA的方法，其特征在于，步骤(2)中所述硅胶膜柱的容积为20mL～22mL，硅胶膜柱的硅胶模直径为25mm～26mm，厚度为3mm～4mm。3.根据权利要求1所述的从粪便中提取富集人源DNA的方法，其特征在于，步骤(1)中所述除杂液A为65mg～75mg/mL的Ca(OH)2悬液；所述除杂液B为含0.15％～0.25％壳聚糖的醋酸溶液。4.根据权利要求1～3任一项所述的从粪便中提取富集人源DNA的方法，其特征在于，步骤(3)中所述富集目标人源DNA包括以下步骤：向纯化的DNA溶液中加入杂交缓冲液，以及与目标人源DNA片段序列互补配对的捕获探针混合液，加热变性后杂交；加入磁珠悬液震荡孵育；静置后去除上清；加入洗涤液B重悬磁珠，静置后去除上清；加入释放缓冲液，90℃～98℃变性5～10min后，冰上静置；吸取上清，即为富集的目标人源DNA。5.根据权利要求4所述的从粪便中提取富集人源DNA的方法，其特征在于，所述捕获探针混合液包...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘志明，吴诗扬，许嘉森，黄洁芬，曾杰，
申请(专利权)人：益善生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：