人BMP3和NDRG4基因甲基化检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及了一种人BMP3和NDRG4基因甲基化检测试剂盒，该试剂盒包括酶切反应液，所述酶切反应液包含酶切缓冲液、甲基化依赖型限制性内切酶，还包括针对BMP3基因和/或NDRG4基因的CpG岛分别设计的引物和部分双链线性DNA探针的荧光PCR反应液。本发明专利技术所述检测试剂盒能够实现在一管中依次进行酶切反应和荧光PCR反应以检测BMP3和NDRG4基因甲基化状态，具有操作简单快速、灵敏度高、特异性好、易于自动化的特点。特点。

【技术实现步骤摘要】
人BMP3和NDRG4基因甲基化检测试剂盒


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种人BMP3和NDRG4基因甲基化检测试剂盒。
技术背景
[0002]表观遗传程序的紊乱是结直肠癌发生的重要原因(Liu R et al.,Mutat Res,2019,779:45
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57)。DNA甲基化改变是最重要的表观遗传变化，控制着特定基因的转录和表达，在结直肠癌发生中起着重要作用。在癌变的早期和晚期，甲基化基因的沉默经常发生在腺瘤
‑
癌级联的局灶性病变中。因此，甲基化改变驱动了结直肠癌的发生和进展。基因甲基化检测可能有助于识别早期结直肠癌个体，可能有助于改善疾病结局。
[0003]BMP3，即骨形态发生蛋白3，其基因编码转化生长因子β(TGF
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β)超家族蛋白的分泌配体，在骨形成中具有重要功能。BMP3基因甲基化可在多种肿瘤中被检测到，包括结直肠癌、胰腺癌、胃癌、肺癌、乳腺癌和胆管癌(Kisiel JB et al.,J Mol Biomark Diagn,2013,4:1000145)。在结直肠癌中，BMP3基因异常甲基化可下调BMP3表达，BMP3失活是结直肠癌发生的早期和常见事件(Loh K et al.,Genes Chromosomes Cancer,2008,47:449
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60)。研究表明，粪便样本BMP3甲基化诊断结直肠癌的总体灵敏度和特异性分别为70％和89％(Liu R et al.,Mutat Res,2019,779:45
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57)。
[0004]NDRG4，即N
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Myc下游调控基因4，为NDRG基因家族成员，其参与细胞增殖、分化、发育和应激(Shi HH et al.,BMB Rep,2020,53:658
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663)。NDRG4在人类恶性肿瘤中发挥着多种作用(Shi HH et al.,BMB Rep,2020,53:658
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663)。在胶质母细胞瘤中，NDRG4起着癌基因的作用，其对星形胶质细胞的存活至关重要；在恶性脑膜瘤中，NDRG4通过抑制p53表达抑制细胞凋亡而起到致癌作用。但是，NDRG4在其它肿瘤如结直肠癌、胃癌、乳腺癌、胰腺癌中具有抑癌作用。NDRG4启动子甲基化可在胃癌、结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌中被检测到，并可导致NDRG4表达下调。研究表明，NDRG4甲基化诊断结直肠癌的总体灵敏度和特异性分别为76％和82％(Liu R et al.,Mutat Res,2019,779:45
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57)。
[0005]鉴于BMP3和NDRG4分别对结直肠癌筛查具有较高的诊断价值，近年来联合检测BMP3和NDRG4基因甲基化在结直肠癌诊断中的应用也备受关注。研究表明，粪便样本中BMP3和NDRG4基因甲基化状态的联合是一个非常有用的标志物，其诊断结直肠癌的灵敏度和特异性分别达89％和87％(Liu R et al.,Mutat Res,2019,779:45
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57)。可见，联合检测BMP3和NDRG4基因甲基化在结直肠癌筛查中具有更好的诊断性能。
[0006]目前BMP3和NDRG4基因甲基化检测的方法主要为基于亚硫酸氢盐转化的荧光PCR法。该方法是利用亚硫酸氢盐对DNA样本进行处理，将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，然后以经亚硫酸氢盐处理后的DNA样本为模板，利用特异性引物和荧光探针进行荧光PCR，根据检测荧光信号以判断甲基化状态，如中国专利申请CN201510486088.7和CN201710090789.8。上述两项中国专利申请所述试剂盒虽然具有较好的灵敏度和/或特异性，但却未能解决亚硫酸氢盐转化带来的缺陷，如：转化条件剧烈易造成DNA样本降解；转化后需DNA纯化和回收，操作步骤繁琐；转化不完全可能造成检测结果偏倚；等。因此，有必要
提供一种无需亚硫酸氢盐转化、操作简单快速、检测准确的BMP3和NDRG4基因甲基化检测试剂盒。

技术实现思路

[0007]基于此，本专利技术提供一种人BMP3和NDRG4基因甲基化检测试剂盒，该试剂盒利用甲基化依赖型限制性内切酶结合特殊设计的多重荧光PCR体系，能过够并行一次性实现酶切反应和多重荧光PCR反应以同时检测BMP3和NDRG4基因甲基化，具有操作简单快速、灵敏度高、特异性好特点。
[0008]为了实现上述目的，本专利技术的技术方案包括如下。
[0009]人BMP3和/或NDRG4基因甲基化检测试剂盒，其包括酶切反应液，所述酶切反应液包含甲基化依赖型限制性内切酶；
[0010]还包括针对BMP3基因和/或NDRG4基因的CpG岛分别设计的引物和部分双链线性DNA探针的荧光PCR反应液；
[0011]每种基因的所述部分双链线性DNA探针包含一条碱基数长的荧光探针和一条碱基数短的淬灭探针；所述荧光探针5
’
端标记有荧光报告基团，3
’
端标记有荧光淬灭基团；所述淬灭探针与荧光探针的5
’
端完全互补，3
’
端标记有荧光淬灭基团；针对不同基因的荧光报告基团不同。
[0012]在其中一些实施例中，针对BMP3基因的引物如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.2所示，和/或针对NDRG4基因的引物如SEQ ID NO.5至SEQ ID NO.6所示。
[0013]在其中一些实施例中，针对BMP3基因的探针包括如SEQ ID NO.3所示的荧光探针和如SEQ ID NO.4所示的淬灭探针；和/或针对NDRG4基因的探针包括如SEQ ID NO.7所示的荧光探针和SEQ ID NO.8所示的淬灭探针。
[0014]在其中一个实施例中，所述荧光报告基团包括FAM、VIC、ROX或CY5；所述荧光淬灭基团为BHQ。当荧光PCR体系中无模板扩增时，荧光探针与淬灭探针结合，使得荧光报告基团和淬灭基团极为接近，有效淬灭荧光信号；当体系中有模板扩增存在时，荧光探针优先与扩增产物稳定结合，与淬灭探针分离，在PCR反应中释放出荧光信号。
[0015]在其中一些实施例中，所述甲基化依赖型限制性内切酶用于消化DNA样本中发生甲基化的BMP3和NDRG4基因DNA，其选自MspJI、FspEI和LpnPI任意一种；优选地，所述甲基化依赖型限制性内切酶为MspJI，所述MspJI用量为1～2U/反应；更优选地，所述MspJI用量为1.5U/反应。
[0016]所述酶切反应液还包含酶切缓冲液、酶活性液、和无核酸酶的水；所述酶活性液用于刺激甲基化依赖型限制性内切酶的消化作用，为短的双链寡核苷酸溶于10mM Tris
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HCl(pH值8.0)而制成的溶液，所述短的双链寡核苷酸为茎环结构，包含两个甲基化位点；优选地，所述短的双链寡核苷酸序列如SEQ ID NO.13，所述酶活性液为含浓度为150
±
1nM短的双链寡核本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.人BMP3和/或NDRG4基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括酶切反应液，所述酶切反应液包含甲基化依赖型限制性内切酶；还包括针对BMP3基因和/或NDRG4基因的CpG岛分别设计的引物和部分双链线性DNA探针的荧光PCR反应液；其中，每种基因的所述部分双链线性DNA探针包含一条碱基数长的荧光探针和一条碱基数短的淬灭探针；所述荧光探针5
’
端标记有荧光报告基团，3
’
端标记有荧光淬灭基团；所述淬灭探针与荧光探针的5
’
端完全互补，3
’
端标记有荧光淬灭基团；针对不同基因的荧光报告基团不同。2.根据权利要求1所述的人BMP3和/或NDRG4基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，针对BMP3基因的引物如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.2所示，和/或针对NDRG4基因的引物如SEQ ID NO.5至SEQ ID NO.6所示。3.根据权利要求1所述的人BMP3和/或NDRG4基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，针对BMP3基因的探针包括如SEQ ID NO.3所示的荧光探针和如SEQ ID NO.4所示的淬灭探针；和/或针对NDRG4基因的探针包括如SEQ ID NO.7所示的荧光探针和SEQ ID NO.8所示的淬灭探针。4.根据权利要求1所述的人BMP3和/或NDRG4基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述甲基化依赖型限制性内切酶选自MspJI、FspEI和LpnPI任意一种；优选地，所述甲基化依赖型限制性内切酶为MspJI。5.根据权利要求4所述的人BMP3和/或NDRG4基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述MspJI用量为1～2U/反应；更优选地，所述MspJI用量为1.5U/反应。6....

【专利技术属性】
技术研发人员：许嘉森，吴诗扬，刘芳，刘志明，
申请(专利权)人：益善生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：