用于多重核酸测序的Index和引物制造技术

本发明专利技术涉及分子生物学技术领域，具体涉及用于多重核酸测序的Index和构建16SrRNA多重核酸测序文库的PCR引物。本发明专利技术提供的Index充分考虑到索引标签之间的序列差异程度、碱基识别率以及测序反应对不同Index序列的数据产出偏好性，将其包含于测序或建库引物后，混合测序反应得到的测序数据平衡性相对较好。本发明专利技术提供的PCR引物非常适用于土壤样品，特异性强，目的扩增条带清晰、无弥散现象，使得土壤样品中细菌多样性研究更加高效便捷准确。本发明专利技术提供的PCR引物中含有本发明专利技术提供的Index，获得的扩增产物中含有两个Index标签，将该Index用于混合样品测序，能够实现对不同测序文库的区分。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学
，具体涉及用于多重核酸测序的Index和构建16SrRNA多重核酸测序文库的PCR引物。
技术介绍
微生物多样性，尤其是细菌多样性微和农业、医学、食品以及工业生产等诸多领域有密切联系。随着分子生物学技术的不断发展，微生物多样性研究方法也逐渐完善和成熟。在微生物进化过程中，核糖体RNA(尤其是细菌的16SrRNA或真菌的18S rRNA)，具有一定的进化保守性，保守区序列为所有同类微生物所共有，在保守序列之间存在由于进化造成的物种之间序列差异的可变区域，因此被认为是最适合系统分类的基因之一。通过对这些序列可变区域的测定和比对，能够探究并揭示土壤中微生物物种和群落结构的多样性。随着基因测序技术的发展，高通量测序技术也被引入微生物多样性的研究技术中。在高通量测序技术中，为了节约测序成本或研究需要，通常会将不同样品混合测序，称为多重测序(Multiplexedsequencing)技术，即在构建测序文库时，借助PCR引物，用不同的索引标签(Index)标记不同样品后，将不同样品混合起来上机测序，测序结束后通过识别Index来区分同一条泳道(Lane)中的不同样品数据。多重测序技术极大程度的降低了测序成本，节约测序资源，并且给生物学研究提供的便利手段。例如，在进行细菌等微生物多样性研究时，通常需要对数百个样品的多样性进行分析，若没有多重测序技术，科研成本和时间成本将大大增加。一方面，实际测序反应对不同的Index序列具有一定的数据产出偏好性，造成检测插入片段时光强参数的波动，影响输出的数据质量和平衡性，即Index序列一定程度影响混合样品的测序数据的准确性，并非任何核苷酸序列都适合用作Index。因此，提供更多的可用Index序列对多重测序
非常重要。另一方面，专利技术人在进行微生物多样性研究时发现：目前常规的用于细菌样品多样性研究的16S rRNA扩增引物(如Illunima公司提供的16S rRNA扩增引物)虽然能够对肠道样品获得相对较好的扩增效果；但当用于复杂性较强、杂质较多的土壤样品时，扩增产物特异性不高，电泳显示扩增条带弥散严重，这将严重影响后续测序和分析结果的准确性。综上所述，提供一组测序数据平衡性相对更好的Index序列以及一组适用于构建土壤样品中细菌16SrRNA多重测序文库的PCR引物，能够使得土壤细菌多样性研究工作更加高效便捷。
技术实现思路
除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属
的普通技术人员通常理解的相同意义。本专利技术中的术语“Index”指索引标签，具体指一段用于区分不同测序样品的核苷酸序列；术语“PCR”指聚合酶链式反应；术语“连接子”指任意一段和待测序的核苷酸序列之间不存在超过连续5个碱基以上的特异性配对的核苷酸序列。本专利技术同时考虑索引标签对PCR引物的扩增效率和数据产出的偏好性的影响，提供了一组用于标记待测序核酸样品的索引标签，所述的一组索引标签包含以下34个Index中的2个或多个；所述的34个Index的核苷酸序列如下表所示：本专利技术还提供了上述Index用于测序文库的构建和/或用于测序的用途：将所述的Index包含在用于扩增待测序序列的PCR引物中，从而构成相对应的Index-PCR引物，通过PCR方法将上述Index引入待测序序列中；所述的Index-PCR引物用可以用作PCR的3’端引物或5’端引物，或同时用作3’端引物和5’端引物。其中，在所述的Index-PCR引物中，所述的Index通过或者不通过连接子与用于扩增待测序序列的PCR引物的5’端或3’端相连。其中，所述的待测序序列优选为细菌16SrRNA序列。由于土壤中除了细菌之外，还含有大量真菌、动物、植物等的遗传物质，在利用16SrRNA测序进行细菌多样性研究时，土壤样品相较于肠道等其他类型的样品往往具有更高的复杂性。现有的构建测序文库的16SrRNA扩增引物用于肠道样品时，能够保证一定的特异性；然而用于土壤样品时，由于其复杂性，往往无法获得理想的扩增产物，获得的扩增产物特异性差，电泳条带弥散严重。本专利技术的另一个目的是提供了一组用于构建16SrRNA多重测序文库的PCR引物。所述的一组用于构建16SrRNA多重测序文库的PCR引物包括正向引物组和反向引物组；所述的正向引物组中的任意一条引物和反向引物组中的任意一条引物两两配对组成引物对，通过PCR反应用于扩增样品中的16S rRNA；获得的扩增产物的上游和下游各含有一个Index，这两个Index作为该样品的特异性标记，用于和其他待测序样品进行区分。获得的扩增产物连接测序接头后，可混合上机测序；所述的正向引物组和反向引物组中不能含有包含相同Index的引物。所述的正向引物组由以下引物中的一条或多条组成：引物F1：包含本专利技术所述的Index1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；引物F2：包含本专利技术所述的Index2，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；引物F3：包含本专利技术所述的Index3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；引物F4：包含本专利技术所述的Index4，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；引物F5：包含本专利技术所述的Index5，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；引物F6：包含本专利技术所述的Index6，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；引物F7：包含本专利技术所述的Index7，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；引物F8：包含本专利技术所述的Index8，其核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；引物F9：包含本专利技术所述的Index9，其核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；引物F10：包含本专利技术所述的Index10，其核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；引物F11：包含本专利技术所述的Index11，其核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示；引物F12：包含本专利技术所述的Index12，其核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示；引物F13：包含本专利技术所述的Index13，其核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示；引物F14：包含本专利技术所述的Index14，其核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示；引物F15：包含本专利技术所述的Index15，其核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示；引物F16：包含本专利技术所述的Index16，其核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示；引物F17：包含本专利技术所述的Index17，其核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示；引物F18：包含本专利技术所述的Index18，其核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示；引物F19：包含本专利技术所述的Index19，其核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示；引物F20：包含本专利技术所述的Index20，其核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示；引物F21：包含本专利技术所述的Index21，其核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示；引物F22：包含本专利技术所述的Index22，其核苷酸序列如SEQ ID NO：22所示；引物F23：包含本专利技术所述的Index23，其核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示；引物F24：包含本专利技术所述的Index24，其核苷酸序列如SE本文档来自技高网...

【技术保护点】
一组用于标记待测序核酸样品的索引标签，其特征在于：所述的一组索引标签包含以下34个Index中的2个或多个，所述的34个Index的核苷酸序列为：

【技术特征摘要】
1.一组用于标记待测序核酸样品的索引标签，其特征在于：所述的一组索引标签包含以下34个Index中的2个或多个，所述的34个Index的核苷酸序列为：2.权利要求1所述的一组用于标记待测序核酸样品的索引标签用于测序文库的构建和/或用于测序的用途，其特征在于：将所述的Index包含在用于扩增待测序序列的PCR引物中，从而构成相对应的Index-PCR引物，通过PCR方法将上述Index引入待测序序列中；所述的Index-PCR引物用可以用作PCR的3’端引物或5’端引物，或同时用作3’端引物和5’端引物。3.如权利要求2所述的用途，其特征在于：在所述的Index-PCR引物中，所述的Index通过或者不通过连接子与用于扩增待测序序列的PCR引物的5’端或3’端相连。4.一组用于构建16SrRNA多重测序文库的PCR引物，其特征在于：所述的一组PCR引物包括正向引物组和反向引物组；所述的正向引物组由以下引物中的一条或多条组成：引物F1：其序列中含有权利要求1所述的Index1，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的序列；引物F2：其序列中含有权利要求1所述的Index2，其核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示的序列；引物F3：其序列中含有权利要求1所述的Index3，其核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示的序列；引物F4：其序列中含有权利要求1所述的Index4，其核苷酸序列为SEQ ID NO：4所示的序列；引物F5：其序列中含有权利要求1所述的Index5，其核苷酸序列为SEQ ID NO：5所示的序列；引物F6：其序列中含有权利要求1所述的Index6，其核苷酸序列为SEQ ID NO：6所示的序列；引物F7：其序列中含有权利要求1所述的Index7，其核苷酸序列为SEQ ID NO：7所示的序列；引物F8：其序列中含有权利要求1所述的Index8，其核苷酸序列为SEQ ID NO：8所示的序列；引物F9：其序列中含有权利要求1所述的Index9，其核苷酸序列为SEQ ID NO：9所示的序列；引物F10：其序列中含有权利要求1所述的Index10，其核苷酸序列为SEQ ID NO：10所示的序列；引物F11：其序列中含有权利要求1所述的Index11，其核苷酸序列为SEQ ID NO：11所示的序列；引物F12：其序列中含有权利要求1所述的Index12，其核苷酸序列为SEQ ID NO：12所示的序列；引物F13：其序列中含有权利要求1所述的Index13，其核苷酸序列为SEQ ID NO：13所示的序列；引物F14：其序列中含有权利要求1所述的Index14，其核苷酸序列为SEQ ID NO：14所示的序列；引物F15：其序列中含有权利要求1所述的Index15，其核苷酸序列为SEQ ID NO：15所示的序列；引物F16：其序列中含有权利要求1所述的Index16，其核苷酸序列为SEQ ID NO：16所示的序列；引物F17：其序列中含有权利要求1所述的Index17，其核苷酸序列为SEQ ID NO：17所示的序列；引物F18：其序列中含有权利要求1所述的Index18，其核苷酸序列为SEQ ID NO：18所示的序列；引物F19：其序列中含有权利要求1所述的Index19，其核苷酸序列为SEQ ID NO：19所示的序列；引物F20：其序列中含有权利要求1所述的Index20，其核苷酸序列为SEQ ID NO：20所示的序列；引物F21：其序列中含有权利要求1所述的Index21，其核苷酸序列为SEQ ID NO：21所示的序列；引物F22：其序列中含有权利要求1所述的Index22，其核苷酸序列为SEQ ID NO：22所示的序列；引物F23：其序列中含有权利要求1所述的Index23，其核苷酸序列为SEQ ID NO：23所示的序列；引物F24：其序列中含有权利要求1所述的Index24，其核苷酸序列为SEQ ID NO：24所示的序列；引物F25：其序列中含有权利要求1所述的Index25，其核苷酸序列为SEQ ID NO：25所示的序列；引物F26：其序列中含有权利要求1所述的Index26，其核苷酸序列为SEQ ID NO：26所示的序列；引物F27：其序列中含有权利要求1所述的Index27，其核苷酸序列为SEQ ID NO：27所示的序列；引物F28：其序列中含有权利要求1所述的Index28，其核苷酸序列为SEQ ID NO：28所示的序列；引物F29：其序列中含有权利要求1所述的Index29，其核苷酸序列为SEQ ID NO：29所示的序列；引物F30：其序列中含有权利要求1所述的Index30，其核苷酸序列为SEQ ID NO：30所示的序列；引物F31：其序列中含有权利要求1所述的Index31，其核苷酸序列为SEQ ID NO：31所示的序列；引物F32：其序列中含有权利要求1所述的Index32，其核苷酸序列为SEQ ID NO：32所示的序列；引物F33：其序列中含有权利要求1所述的Index33，其核苷酸序列为SEQ ID NO：33所示的序列；引物F34：其序列中含有权利要求1所述的Index34，其核苷酸序列为SEQ ID NO：34所示的序列；所述的反向引物组由以下引物中的一条或多条组...

【专利技术属性】
技术研发人员：王绪敏，
申请(专利权)人：中国科学院北京基因组研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11