基于转录测序获得黑果枸杞SSR引物的方法技术

本发明专利技术涉及一种基于转录测序获得黑果枸杞SSR引物的方法，属于生物学分子遗传分子标记技术技术领域，其步骤如下：(1)转录组测序；(2)筛选EST‑SSR位点；(3)引物设计；(4)提取DNA；(5)引物筛选；(6)使用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行多态性引物筛选。本发明专利技术的基于转录测序获得黑果枸杞SSR引物的方法，可作为校正远亲物种间基因组连锁图谱与比较作图的方法，在这两方面有较高的利用价值。其最大的优点是开发简单、快捷、费用低。利用SSR分子标记技术明确黑果枸杞SSR的总体特点，开发黑果枸杞SSR引物，为利用SSR分子标记进行黑果枸杞种质资源遗传多样性、连锁图谱构建及亲缘关系研究奠定基础，从而更好地应用在分子育种中。

【技术实现步骤摘要】
基于转录测序获得黑果枸杞SSR引物的方法
本专利技术涉及一种获得SSR引物的方法，特别涉及一种基于转录测序获得黑果枸杞SSR引物的方法，属于生物学分子遗传分子标记技术

技术介绍
简单重复序列(simplesequenceRepeats，SSR)，也称作微卫星DNA(MicrosatelliteDNA)是指一类由几个(多为1～6个)碱基组成的基元串联重复而成的DNA序列，如(AT)n、(GCA)n、(AATC)n等重复，它广泛而均匀地分布于真核生物基因组中。由于多态性高、技术重复性好，易于操作等优点，自上世纪九十年代初以来，SSR标记一直作为一种优良的分子标记而被广泛应用于物种的遗传分析。人们对微卫星DNA在人类、动物以及植物中的发生与分布做了大量的研究。SSR标记的传统开发涉及一系列繁复的操作过程，不仅效率低下，而且由于成本因素的限制，长期以来使得SSR标记仅在模式植物或者是经济价值较高的作物上得到开发和应用。SSR两端的序列多是相对保守的单拷贝序列，人们常常根据其两端的序列设计特异引物进行扩增，根据扩增产物长短的变化而显示不同基因型的个体在每个SSR位点上的多态性。SSR根据序列来源，一般分为基因组gSSR(genomicSSR)和EST-SSR(eSSR)两种。黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.)为茄科枸杞属多年生灌木植物，是我国西北荒漠地区一种特有的野生植物，主要分布于青海、新疆、内蒙、宁夏、甘肃等地。该种耐盐、抗旱，多分布于盐碱土荒地、池地或路旁，对盐渍土壤有很强的适应性。但与宁夏红果枸杞相比，黑果枸杞在繁育手段及品种鉴定等方面存在明显的差距，在分子标记研究方面，仅见到有关于SRAP的报道，未见关于其基因组信息或转录组信息的报道。随着对黑果枸杞栽培品种需求的日益增加，关于黑果枸杞分子标记辅助的问题也迫切需要研究和解决。目前，黑果枸杞尚无基因组信息，SSR引物数量较少。因此，如何基于转录测序获得黑果枸杞SSR引物，从而更好地研究不同种源之间的亲缘关系，用于黑果枸杞分子育种，为获得大量优秀种质资源奠定基础，就成为该
急需解决的技术难题。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种基于转录测序获得黑果枸杞SSR引物的方法，从而更好地研究不同种源之间的亲缘关系，用于黑果枸杞分子育种，为获得大量优秀种质资源奠定基础。为实现上述目的，本专利技术采取以下技术方案：一种基于转录测序获得黑果枸杞SSR引物的方法，其步骤如下：(1)取3个种源地的黑果枸杞作为样本，将地上部分做转录组测序；(2)使用在线微卫星位点扫描工具SSRIT(或MISA软件)检测EST-SSR位点，SSR≥20bp，搜索设置为三核苷酸最低重复6次，四核苷酸最低重复5次，五核苷酸最低重复4次，六核苷酸最低重复3次；(3)采用软件primer3.0进行SSR引物设计，引物参数设置为长度18-25bp，Tm55-65℃，产物大小为100-300bp；(4)使用CTAB法提取10个种源地黑果枸杞的DNA，每个种源地取25个样品作为重复；(5)利用PRIMERPREMIER5.0对(3)中的引物以及它们对应的SSR位点进行进一步随机筛选检验，所筛选出的引物序列送到公司进行合成，合成后进行PCR扩增；(6)使用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行多态性引物筛选：根据跑胶结果所显示条带，同种引物在不同种源地能扩增出差异条带的，认为具有多态性。优选地，所述步骤(1)中所述转录组测序中，处理分为对照组、盐处理组与混合盐处理组，其中盐处理组使用100mL、pH＝7、200mmol/L的NaCl溶液，混合盐处理组使用100mL、pH＝8.54、Na2CO3、NaCl、Na2SO4、NaHCO3按照1:9:9:1混合的终浓度为200mmol/L的混合溶液。优选地，所述步骤(1)中所述转录组测序的具体步骤如下：CTAB法提取黑果枸杞总RNA，分离mRNA，合并成双链cDNA，加腺嘌呤和测序接头，对大小在200bp－700bp的片段进行扩增，用IlluminaHiSeq2000对扩增后的文库进行检测，利用trinity软件拼接测序数据，使每条基因中最长的转录本编号为1个unigene。优选地，所述步骤(5)中所述PCR扩增使用的PCR仪为BoiRadT100型号。优选地，所述步骤(4)中所述提取10个种源地黑果枸杞的DNA的具体步骤如下：①取超低温保存的叶片样本，研钵磨碎后加入2.0ml离心管中(加入的叶片粉末量没过2.0ml离心管的底部的尖端即可；②迅速加入65℃预热过的CTAB500μl(2％CTAB，使用前加入0.5-1％β-巯基乙醇)，混合均匀后放入65℃水浴半小时，每十分钟摇动一次，使CTAB与叶片样本充分混匀；③取出离心管放置2分钟后，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)混合液，将混合液与CTAB混匀后，涡旋混合，使CTAB与氯仿充分接触；④12000rpm离心10分钟，吸取上清液至1.5ml离心管中；⑤加入二倍体积无水乙醇洗涤DNA沉淀，12000rpm离心10min，弃上清；⑥将乙醇洗涤过的DNA风干(超净工作台吹一下或者真空浓缩仪)；⑦风干后用50μlddH2O溶解，得DNA浓度为30ng/μl，-20℃保存待用。优选地，所述步骤(5)中所述进一步随机筛选检验的具体步骤为：SSR≥20bp，搜索设置为三核苷酸最低重复6次，四核苷酸最低重复5次，五核苷酸最低重复4次，六核苷酸最低重复3次；引物参数设置为长度18-25bp，Tm58-63℃，产物大小为100-300bp；选取77对引物。优选地，所述步骤(5)中所述PCR扩增所用的反应体系为Mix10μl，DNA1μl，上游引物和下游引物各1μl，ddH2O7μl；反应过程：预变性95℃，5min，变性：95℃，持续30s，退火：60℃，持续30s，延伸：72℃，持续30s，34次循环，得到扩增产物。优选地，所述步骤(6)的具体过程如下：①配制8％非变性聚丙烯酰胺凝胶：ddH2O30mL，10×TBE4mL，丙烯酰胺6mL，TEMED40μl，最后加20％过硫酸铵200μl，等待凝胶时间40min；②电压130v，电流250mA，功率30w，取2.5μl扩增产物，跑胶1小时15分钟；③将跑好的胶放入容器内，加入200mL蒸馏水，放至摇床上，打开摇床100r左右，再加2mL硝酸银溶液，遮光反应10min；④倒掉液体，蒸馏水冲洗3次，加入200mL1.5％氢氧化钠溶液，放至摇床上，打开摇床，再加1mL甲醛溶液，遮光反应10min。本专利技术的另一目的是提供一种能鉴定黑果枸杞品种和种苗纯度的引物。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案达到的：鉴定黑果枸杞品种的引物组，其特征在于：包括11对SSR多态性引物：(1)U20上游引物：CCCACTTCTCAAAAATGGTACAC，下游引物：ATAGTTGCCAACAAACCCTTCTT；(2)U21上游引物：GGATGAAGAAGAAGAGGATGACA，下游引物：CTTCTCAAAAATGGTACACTGCC；(3)U23上游引物：CTACTTCCATTTGTGGAAAGCTG，下游引物：TAGCCAGTCTAATCTTCGGTTTG；(4)U2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于转录测序获得黑果枸杞SSR引物的方法，其步骤如下：(1)取3个种源地的黑果枸杞作为样本，将地上部分做转录组测序；(2)使用在线微卫星位点扫描工具SSRIT或MISA软件检测EST‑SSR位点，SSR≥20bp，搜索设置为三核苷酸最低重复6次，四核苷酸最低重复5次，五核苷酸最低重复4次，六核苷酸最低重复3次；(3)采用软件primer3.0进行SSR引物设计，引物参数设置为长度18‑25bp，Tm 55‑65℃，产物大小为100‑300bp；(4)使用CTAB法提取10个种源地黑果枸杞的DNA，每个种源地取25个样品作为重复；(5)利用PRIMER PREMIER 5.0对(3)中的引物以及它们对应的SSR位点进行进一步随机筛选检验，所筛选出的引物序列送到公司进行合成，合成后进行PCR扩增；(6)使用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行多态性引物筛选：根据跑胶结果所显示条带，同种引物在不同种源地能扩增出差异条带的，认为具有多态性。

【技术特征摘要】
1.一种基于转录测序获得黑果枸杞SSR引物的方法，其步骤如下：(1)取3个种源地的黑果枸杞作为样本，将地上部分做转录组测序；(2)使用在线微卫星位点扫描工具SSRIT或MISA软件检测EST-SSR位点，SSR≥20bp，搜索设置为三核苷酸最低重复6次，四核苷酸最低重复5次，五核苷酸最低重复4次，六核苷酸最低重复3次；(3)采用软件primer3.0进行SSR引物设计，引物参数设置为长度18-25bp，Tm55-65℃，产物大小为100-300bp；(4)使用CTAB法提取10个种源地黑果枸杞的DNA，每个种源地取25个样品作为重复；(5)利用PRIMERPREMIER5.0对(3)中的引物以及它们对应的SSR位点进行进一步随机筛选检验，所筛选出的引物序列送到公司进行合成，合成后进行PCR扩增；(6)使用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行多态性引物筛选：根据跑胶结果所显示条带，同种引物在不同种源地能扩增出差异条带的，认为具有多态性。2.根据权利要求1所述的基于转录测序获得黑果枸杞SSR引物的方法，其特征在于：所述步骤(1)中所述转录组测序中：处理分为对照组、盐处理组与混合盐处理组，其中盐处理组使用100mL、pH＝7、200mmol/L的NaCl溶液，混合盐处理组使用100mL、pH＝8.54、Na2CO3、NaCl、Na2SO4、NaHCO3按照1:9:9:1混合的终浓度为200mmol/L的混合溶液。3.根据权利要求2所述的基于转录测序获得黑果枸杞SSR引物的方法，其特征在于：所述步骤(1)中所述转录组测序的具体步骤如下：CTAB法提取黑果枸杞总RNA，分离mRNA，合并成双链cDNA，加腺嘌呤和测序接头，对大小在200bp－700bp的片段进行扩增，用IlluminaHiSeq2000对扩增后的文库进行检测，利用trinity软件拼接测序数据，使每条基因中最长的转录本编号为1个unigene。4.根据权利要求3所述的基于转录测序获得黑果枸杞SSR引物的方法，其特征在于：所述步骤(5)中所述进一步随机筛选检验的具体步骤为：SSR≥20bp，搜索设置为三核苷酸最低重复6次，四核苷酸最低重复5次，五核苷酸最低重复4次，六核苷酸最低重复3次；引物参数设置为长度18-25bp，Tm58-63℃，产物大小为100-300bp；选取77对引物。5.根据权利要求4所述的基于转录测序获得黑果枸杞SSR引物的方法，其特征在于：所述步骤(5)中所述PCR扩增使用的PCR仪为BioRadT100。6.根据权利要求5所述的基于转录测序获得黑果枸杞SSR引物的方法，其特征在于：所述步骤(4)中所述提取10个种源地黑果枸杞的DNA的具体步骤如下：①取超低温保存的叶片样本，研钵磨碎后加入2.0ml离心管中，加入的叶片粉末量没过2.0ml离心管的底部的尖端即可；②迅速加入65℃预热过的CTAB2％CTAB，使用前加入0.5-1％β-巯基乙醇，500μl，混合均匀后放入65℃水浴半小时，每十分钟摇动一次，使CTAB与叶片样本充分混匀；③取出离心管放置2分钟后，加入等体积的24:1的氯仿/异戊醇混合液，将混合液与CTAB混匀后，涡旋混合，使CTAB与氯仿充分接触；④12000rpm离心10分钟，吸取上清液至1.5ml离心管中；⑤加入二倍体积无水乙醇洗涤DNA沉淀，12000rpm离心10min，弃上清；⑥将乙醇洗涤过的DNA风干；⑦风干后用50μlddH2O溶解，得DN...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈金焕，张东智，饶书培，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11