定性检测STAT4基因分型的焦磷酸测序引物对及试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种定性检测STAT4基因分型的焦磷酸测序引物对。所述引物对包括正向扩增引物、反向扩增引物、测序引物，所述反向扩增引物的5’端分别进行生物素标记。本发明专利技术还涉及一种定性检测STAT4基因分型的焦磷酸测序试剂盒。所述试剂盒包括扩增引物、PCR反应液、测序引物、尿嘧啶DNA糖基化酶及Taq聚合酶。本发明专利技术具有检测结果准确、特异性高、检测周期短、操作简单并能有效满足临床检验要求的优点；此外，还具有可实时监测反应进程、反应时间短、PCR产物简单处理即可上焦磷酸测序仪测序及高通量样品检测，并比金标准方法，即毛细管电泳测序法灵敏度更高的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及体外核酸检测
，尤其涉及一种定性检测STAT4基因分型的焦磷酸测序引物对及试剂盒。
技术介绍
肝癌是全世界致死率高居第三的恶性肿瘤，也是中国常见的一种恶性疾病。全球每年约有70万人死于肝癌。肝癌中肝细胞肝癌(HepatoCellular Carcinoma,HCC)最常见，国际癌症研究机构2000年的调查显示，HCC患者中80％与异性肝炎病毒和丙型肝炎病毒有关。病史调查表明，中国的肝癌病人中80％以上都有乙肝病史。根据卫生部发布的数据，中国目前总计有9300万乙肝病人，占全世界乙肝患者总数的三分之一以上。我国1992年普及乙肝疫苗注射后，肝癌发病率已有所下降。但在之前出生的人，约8％～9％呈乙肝表面抗原(HBsAg)阳性。因此，中国大陆在未来40～50年肝细胞癌仍将是一个重要的公共健康问题。由于原发性肝癌(HCC)患者出现临床表现常属疾病晚期，死亡率高，因此，筛查高危因素用于临床预测乙肝病毒感染的患者并发HCC的风险，有利于疾病的早期发现和治疗。信号转导和激活因子(STAT)家族是近年来发现的一类转录因子，包括STAT1，STAT2，STAT3，STAT4，STAT5a，STAT5b，STAT6。STAT家族是介导细胞因子、生长因子信号通路上启动蛋白转录的重要转录因子，它们在许多信号通路的细胞分子事件中都起到重要作用，例如细胞分化、细胞增殖和存活。STAT4位于染色体2q32.2-2q32.3；是T细胞，NK细胞，树突状细胞,核巨噬细胞等免疫调控细胞内IL-12/STAT4/IFN-γ信号传导途径的关键组成元件，是IL-12诱导免疫调控细胞产生IFN-γ的关键调控因子，介导IL-12的免疫反应与调节T细胞的分化。国外研究证实，STAT4基因多态性参与多种自身免疫性疾病的发生。STAT4通过信号传导，使白细胞介素12诱导产生IFN-γ。IFN-γ是一种多效性细胞因子，在宿主防御中具有重要的作用。由于STAT4基因多态性，激活的IFN-γ可能会降低它的抗病毒和抗肿瘤活性，通过研究证实：STAT4中的G等位基因的单核苷酸多态性与乙肝癌变的高风险有关。2012年12月，复旦大学遗传学研究所、遗传工程国家重点实验室教授余龙，在《自然·遗传学》(Nature Genetics)杂志上发表的《Genetic variants in STAT4and HLA-DQ genes confer risk of hepatitis B virus–related hepatocellular carcinoma》，确定人的STAT4和HLA-DQ基因是乙肝患者罹患肝癌的关键易感基因。余龙课题组联系了海内外30个课题组，66位学者开展协作攻关，收集了国内7个地区、总计11799例乙型肝炎患者的血细胞DNA样本。包括5480例有乙肝病变的肝癌病例和6319例有乙肝病史但无肝癌的对照者。运用全基因组关联分析技术比对分析了这两组人群的全基因组序列中近73万个单核苷酸多态位点的等位基因频率，最终在STAT4基因和HLA-DQ基因簇上发现了与乙肝癌变风险显著关联的易感基因位点。STAT4基因是乙肝患者罹患肝癌的关键易感基因，为人类进一步研究如何降低肝癌发病风险、治疗乙肝和肝癌指出了新的方向。通过检测STAT4基因的分型，筛查肝癌的易感人群，从而提前对易感人群进行相应的综合干预和预防措施，降低肝癌发病风险。因此进行STAT4位点的基因分型检测对于预防乙肝癌变有着非常重要的意义。焦磷酸测序(Pyrosequencing)是一种基于聚合原理的DNA测序(即，确定DNA中核苷酸的顺序)方法，属于新一代DNA序列分析技术，具备同时对大量样品进行测序分析的能力，并具有高通量、特异性高、快速、直观及低成本的优点。其基本原理为，由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)，PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值，每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比；然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成；最后通过分析岀峰值的情况，达到测定DNA序列的目的。不过，现有技术中还没有利用焦磷酸测序技术检测STAT4基因分型的产品。目前，在现有技术中，采用有“金标准”之称的PCR-直接测序法对STAT4基因进行检测，但该方法的敏感性不高，只能检测出突变细胞比率在10-20％以上的肿瘤组织及外周血，对于突变细胞比率小于10％的肿瘤组织及外周血，常规PCR-直接测序法几乎无能为力；此外，该方法还存在成本高、检测周期长及操作繁琐的缺点。
技术实现思路
为了解决上述方法检测STAT4基因分型过程中存在敏感性不高、检测周期长、操作繁琐及成本高的技术问题，本专利技术提供一种敏感性高、特异性强、检测周期短、操作简单并有效满足临床检验要求的定性检测STAT4基因分型的焦磷酸测序引物对及试剂盒。本专利技术提供了一种定性检测STAT4基因分型的焦磷酸测序引物对，所述引物对包括：STAT4正向扩增引物：5’-GGAAAGGTTCACACTTGACTGTT-3’(SEQ ID NO.1)；STAT4反向扩增引物：5’-CCCCTGAAATTCCACTGAAATAAG-3’(SEQ ID NO.2)；STAT4测序引物：5’-AAAAGTTGGTGACCAAAATG-3’(SEQ ID NO.3)；其中，所述STAT4反向扩增引物的5’端进行生物素标记。本专利技术还提供了一种定性检测STAT4基因分型的焦磷酸测序试剂盒，所述试剂盒包括：PCR反应液，所述PCR反应液含有STAT4正向扩增引物：5’-GGAAAGGTTCACACTTGACTGTT-3’；STAT4反向扩增引物：5’-CCCCTGAAATTCCACTGAAATAAG-3’；STAT4测序引物：5’-AAAAGTTGGTGACCAAAATG-3’；其中，所述STAT4反向扩增引物的5’端进行生物素标记。在本专利技术提供的所述试剂盒的一种较佳实施例中，所述试剂盒还包括：STAT4阳性对照品1，其为插有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的STAT4野生纯合子质粒；SEQ ID NO.5：5’-ACACATATGGAAAGGTTCACACTTGACTGTTAATACGGATGTCTTTGAAGGTAGTGGTGTGGATGGAGGTAAGGAAAAAAGAAGTGGGATAAAAAGAAGTTTGTAATTAAAAAGCTACATGTATATTATGATCTACTTTATGGAAAATTACATGAGTGTGTATGCAGTAAAAGTATGAAAAGTTGGTGACCAAAATGTGAATAGTGGTTATCTTATTTCAGTGGAATTTCAGGGGATTTTTTTTCTTTCTTCTTAGACTTTTCATTATCATTTGACTTTTTACAAAGATTTGCATTATTTAAGCAATCAGAAAGAAATTATAAAGCTATTTTCATCATAACAAAAATTCCATTGGTAAAAAATTTTTAATTAATTTACATAATGT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种定性检测STAT4基因分型的焦磷酸测序引物对，其特征在于，所述引物对包括：STAT4正向扩增引物：5’‑GGAAAGGTTCACACTTGACTGTT‑3’；STAT4反向扩增引物：5’‑CCCCTGAAATTCCACTGAAATAAG‑3’；STAT4测序引物：5’‑AAAAGTTGGTGACCAAAATG‑3’；其中，所述STAT4反向扩增引物的5’端进行生物素标记。

【技术特征摘要】
1.一种定性检测STAT4基因分型的焦磷酸测序引物对，其特征在于，所述引物对包括：STAT4正向扩增引物：5’-GGAAAGGTTCACACTTGACTGTT-3’；STAT4反向扩增引物：5’-CCCCTGAAATTCCACTGAAATAAG-3’；STAT4测序引物：5’-AAAAGTTGGTGACCAAAATG-3’；其中，所述STAT4反向扩增引物的5’端进行生物素标记。2.一种定性检测STAT4基因分型的焦磷酸测序试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：PCR反应液，所述PCR反应液含有STAT4正向扩增引物：5’-GGAAAGGTTCACACTTGACTGTT-3’；STAT4反向扩增引物：5’-CCCCTGAAATTCCACTGAAATAAG-3’；STAT4测序引物：5’-AAAAGTTGGTGACCAAAATG-3’；其中，所述STAT4反向扩增引物的5’端进行生物素标记。3.根据权利要求2所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：滕祥云，曾好，
申请(专利权)人：长沙三济生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43