利用通用引物的核酸目标待测位点检测方法技术

本发明专利技术提供了一种检测样品中靶核酸的待测位点目标碱基的方法，其包括向含有样品和聚合酶的循环扩增反应混合物中提供上游内引物、上游外引物、下游引物和探针。本发明专利技术还提供了用于检测样品中靶核酸的突变的方法。本发明专利技术还提供了用于检测样品中靶核酸的单核苷酸多态性的方法。本发明专利技术还提供了用于本发明专利技术方法的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
201410748349

【技术保护点】
一种检测样品中靶核酸的待测位点目标碱基的方法，其包括以下步骤：(a)向含有样品和聚合酶的循环扩增反应混合物中提供上游内引物、上游外引物、下游引物和探针，其中所述上游内引物的3’端为靶序列识别片段，所述靶序列识别片段可特异性与靶核酸杂交并且所述靶序列识别片段的3’端末端对应靶核酸的待测位点，靶序列识别片段的3’端末端的碱基与靶核酸的所述待测位点目标碱基互补，另外，所述上游内引物的5’端为外引物重叠片段，所述外引物重叠片段的序列与靶核酸的序列不互补；其中所述上游外引物的3’端为引物重叠片段，其与上游内引物的5’端的所述外引物重叠片段相同，所述上游外引物的5’端的片段与靶核酸不互补；其中所述探针的3’和5’端分别标记了报告基团和淬灭基团，所述报告基团的信号可被淬灭基团淬灭，所述探针可特异性与所述上游内引物和下游引物的扩增产物中包含对应所述待测位点的片段杂交，并且所述探针中，其5’端至其对应靶核酸的所述待测位点的片段的长度与所述上游内引物的靶序列识别片段的长度相同或少一个或多个核苷酸；(b)实施多个循环扩增步骤，所述循环扩增步骤包括杂交步骤和核酸延长步骤；测量报告基团的信号，由此对靶核酸的待测位点目标碱基进行检测。...

【技术特征摘要】
1.一种检测样品中靶核酸的待测位点目标碱基的方法，其包括以下步
骤：
(a)向含有样品和聚合酶的循环扩增反应混合物中提供上游内引物、
上游外引物、下游引物和探针，
其中所述上游内引物的3’端为靶序列识别片段，所述靶序列识别片段
可特异性与靶核酸杂交并且所述靶序列识别片段的3’端末端对应靶核酸的
待测位点，靶序列识别片段的3’端末端的碱基与靶核酸的所述待测位点目
标碱基互补，另外，所述上游内引物的5’端为外引物重叠片段，所述外引
物重叠片段的序列与靶核酸的序列不互补；
其中所述上游外引物的3’端为引物重叠片段，其与上游内引物的5’
端的所述外引物重叠片段相同，所述上游外引物的5’端的片段与靶核酸不
互补；
其中所述探针的3’和5’端分别标记了报告基团和淬灭基团，所述报
告基团的信号可被淬灭基团淬灭，所述探针可特异性与所述上游内引物和下
游引物的扩增产物中包含对应所述待测位点的片段杂交，并且所述探针中，
其5’端至其对应靶核酸的所述待测位点的片段的长度与所述上游内引物的
靶序列识别片段的长度相同或少一个或多个核苷酸；
(b)实施多个循环扩增步骤，所述循环扩增步骤包括杂交步骤和核酸延
长步骤；测量报告基团的信号，由此对靶核酸的待测位点目标碱基进行检测。
2.权利要求1的方法，其中所述上游内引物为ARMS引物，其3’端
末端的第二至四个核苷酸与对应的靶核酸序列有至少一个核苷酸的错配，优
选的，所述错配是在3’端末端第二个核苷酸。
3.权利要求1或2的方法，其中所述探针的核苷酸序列与以所述待测
位点为目标碱基的靶核酸为模板的所述上游内引物和下游引物的扩增产物中
包含对应所述待测位点的片段互补。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述探针的5’端末端至包含对

\t应所述突变的位点的片段的序列与所述上游内引物的靶序列识别片段相同。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述多个循环扩增步骤包括第
一扩增阶段和第二扩增阶段，在第一扩增阶段中可得到以靶核酸为模板，由
上游内引物与下游引物限定的扩增产物，第二扩增阶段中可得到以第一扩增
阶段得到的扩增产物为模板，由上游外引物与下游引物限定的扩增产物。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中还向所述循环扩增反应混合物
中提供下游外引物，
其中，所述循环扩增反应混合物中的所述下游引物包括3’端的下游引
物靶序列识别片段，其核苷酸序列与靶核酸的序列互补，所述下游引物的5’
端为下游外引物重叠片段，其序列与靶核酸的序列不互补，
所述下游外引物的3’端为下游引物重叠片段，其与下游引物的5’端
的下游外引物重叠片段相同，所述下游外引物的5’端与靶核酸不互补。
7.权利要求6的方法，当循环扩增反应混合物中具有下游外引物时，
第二扩增阶段可得到上游外引物与下游外引物限定的产物。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中在所述核酸延长步骤测量报告
基团的信号，由此对靶核酸的待测位点目标碱基进行检测。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述探针中对应靶核酸待测位
点的碱基的位置位于所述探针中间。
10.权利要求1-9中任一项的方法，其中所述聚合酶具有5’→3’外切
活性，更优选的，所述聚合酶没有3'→5'外切酶活性。
11.权利要求1-10中任一项的方法，其用于检测样品中靶核酸的同一
待测位点上两个目标碱基的方法，其包括以下步骤：
(a)向含有样品和聚合酶的循环扩增反应混合物中提供上游内引物、
上游外引物、下游引物和探针，
其中所述上游内引物包括第一上游内引物和第二上游内引物，所述第一
上游内引物的3’端的靶序列识别片段的3’端末端的碱基与靶核酸的所述待
测位点的第一目标碱基互补；所述第二上游内引物的3’端的靶序列识别片
段的3’端末端的碱基与靶核酸的所述待测位点的第二目标碱基互补；
其中所述探针包括第一探针和第二探针，所述第一探针可特异性与所述
第一上游内引物和下游引物的扩增产物中包含对应所述待测位点的片段杂交；
所述第二探针可特异性与所述第二上游内引物和下游引物的扩增产物中包含
对应所述待测位点的片段杂交；所述第一探针的3’和5’端标记了第一报告
基团和第一淬灭基团；所述第二探针的3’和5’端标记了第二报告基团和第
二淬灭基团；
(b)实施多个循环扩增步骤，所述循环扩增步骤包括杂交步骤和核酸延
长步骤；测量第一和第二报告基团的信号，由此对靶核酸的待测位点目标碱
基进行检测。
12.权利要求11的方法，其中所述第一上游内引物和第二上游内引物
为ARMS引物，优选的，所述ARMS引物的3’端末端的第二至四个核苷酸
与其对应的靶核酸序列有至少一个核苷酸的错配，更优选的，所述错配是在
3’端末端第二个核苷酸。
...

【专利技术属性】
技术研发人员：许越琰，赵海峰，
申请(专利权)人：常州金麦格生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32