本发明专利技术公开了一种梨黑斑病菌的分子检测方法及其引物，该引物具有特异性，能够特异性地从梨黑斑致病菌的基因组DNA中通过PCR扩增出一条254bp的特异性条带，而从其它属种真菌的基因组DNA中不能扩增出条带，从而利用该特异性引物建立了一套快速、高效、稳定可靠的检测梨黑斑病菌的分子检测方法。本发明专利技术方法具有准确、快速、简单易操作等优点，可以在病害侵染初期鉴定出病原物。可用于田间调查和植物产品的检测，对控制梨黑斑病的大面积爆发和跨区域传播具有重要意义，同时，本发明专利技术体系的建立也为其他病原物的检测提供了技术指导和理论支持。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子检测领域，具体涉及检测梨黑斑病菌的PCR引物以及使用该引物 的检测方法。
技术介绍
梨黑斑病又名梨裂果病，是梨树的国际性三大病害之一，在亚洲的日本、韩国和中 国发生非常严重。目前，世界上已报道的从梨果实上分离到的链格孢共有9个组，已命名的 有9个种。在中国已报道的有5个种，分别是梨黑斑链格孢A. gaisen K.N.agano、链格孢 A. alternata(Fr. )Keissler、细极链格抱A. tenuissima(Fr. )Wiltshire、鸭梨侵染链格抱 A.yaliinficiens R.G.Roberts和A.ventricosa R.G.Robert。由于该病可能由多种链格 孢属的病菌引起，该病病原菌的鉴定存在较大分歧，常规的病害诊断技术难以快速准确鉴 定该病原菌。随着分子生物学技术的发展，采用分子检测方法为该病害的诊断提供了很好 的检测手段。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种检测梨黑斑病菌的PCR引物以及使用该 引物的检测方法，通过设计梨黑斑病菌的特异性引物，利用PCR方法将待检样品的DNA扩 增，检测该梨黑斑病菌特异性引物是否能从样品中扩增出特异性条带，可以快速准确地检 出待检样品是否含有梨黑斑病菌，该方法速度快，特异性强，灵敏度高，稳定可靠。 本专利技术提供的技术方案是： 1.设计一种用于检测梨黑斑病菌的引物 本专利技术根据Genbank中已知的Alternaria属的Altal基因序列，设计了一对特 异性引物，其序列为， LiA-F:CCGCATCCTGCCCAGTTA, LiA-R:GGTAACTTACTCGTCGCTA。 2.利用上述引物检测梨黑斑病菌的方法 ⑴提取待测样品DNA; (2)利用所述引物进行PCR反应，反应的扩增体系为：10XTaqbuffer5yL， 25mmol/LMgC12 4yL，2.5mmol/LdNTP2yL，10ymol/L正反向引物各2yL，5U/yLTaq酶 0. 5μL，50ng/μL(或适当浓度）DNA模板1μL，灭菌双蒸水补足至总体积50μL。 (3)按PCR反应条件扩增； (4)取PCR反应扩增产物进行电泳检测，如果存在大小为254bp的DNA条带，则证 明所检测样品中含有梨黑斑病菌。 优选的沖0?反应条件为：941€51^11;941€3〇8,55.8 1€3〇8,721€3〇8,35个循环； 72°C10min，4°C保存。 本专利技术具有以下有益效果： 本专利技术通过设计一对特异性引物，结合PCR扩增的方法，可以有效地检测植物组 织中的梨黑斑病菌。本专利技术方法具有以下技术优势： (1)特异性强。本专利技术所述的特异性引物是根据引起梨黑斑病的Alternaria属 真菌Altai基因序列设计而得，利用该引物可以特异性地从引起梨黑斑病的Alternaria属 菌株扩增得到一条254bp的条带，其他属菌株以及Alternaria属的其他种均无扩增条带出 现，表明该对引物具有属种间特异性。 (2)灵敏度高。高灵敏度是病原菌检测的一个重要指标，它关系到能否将快速检测 技术直接应用在植物产品的检验检疫中。本专利技术所述引物及PCR方法能检测到10pg的病 原菌基因组DNA。 (3)应用范围广。本专利技术中所述特异性引物可以在病害侵染初期鉴定出病原物，可 以广泛应用于田间调查和植物产品的检验，对控制梨黑斑病的大面积爆发和跨区域传播具 有重要意义。 (4)本专利技术体系的建立也为其他病原物的检测提供了技术指导和理论支持。【附图说明】 图 1 引物属间特异性验证。Marker:DL2000 ; 1 :A.gaisen;2 :A.alternata;3 : A.tenuissima;4 :Α·ventricosa;5 :Α·yaliinficiens;6 ~23 :其他属菌株（见表 1) ；24 ： H20〇 图 2 引物种间特异性验证。Marker:DL2000 ; 1 :Α·gaisen;2 :Α·alternata;3 : A.tenuissima;4 :Α·ventricosa;5 :Α·yaliinficiens;6 ~37:Alternaria属其他种菌株 (见表 2) ;38 :H20。 图3引物灵敏度检测。Marker:DL2000 ;1-9:梨黑斑病菌基因组DNA，模板含量 (25μL反应体系）分别为 100ng，10ng，lng，100pg，10pg，lpg，100fg，10fg，lfg;10 :H20。 图4发病梨果实中黑斑病菌的PCR检测。Marker:DL2000;1-2:发病梨果实粗提 取DNA;3-6 :健康梨果实粗提取DNA;7 :分离病菌提取DNA;8 :H20。【具体实施方式】 下面通过详细描述【具体实施方式】来进一步阐明本专利技术，但并不是对本专利技术的限 制，仅作示例说明。 实施例1 :设计、合成引物并建立梨黑斑病菌的PCR反应体系 -、引物设计与合成 通过对Alternaria属38种菌的Altal基因序列的考察，将考察的基因序列进行 序列分析比对，根据比对结果选取了几种梨黑斑致病菌病特异性的片段，设计了一对特异 性引物，序列如下： LiA-F:CCGCATCCTGCCCAGTTA, LiA-R:GGTAACTTACTCGTCGCTA。 引物设计完成后，重新在GeneBank中进行BLAST分析验证其特异性。验证完成后 委托上海生工合成部合成。 二、建立梨黑斑病菌的PCR反应体系 PCR扩增体系为：10XTaqbuffer5yL，25mmol/LMgCl2 4yL，2. 5mmol/LdNTP 2μL，10μmol/L正反向弓丨物各2μL，5U/μLTaq酶0· 5μL，50ng/μL(或适当浓度）DNA模 板1μL,灭菌双蒸水补足至总体积50μL。 在PCR扩增仪上进行扩增反应，反应条件为：94°C5min;94°C30s，55. 8°C30s， 72°〇3〇8,35个循环；72°(：1〇1^11。4°(：保存。 三、结果分析 取5 μ L扩增产物于1. 0%琼脂糖凝胶中电泳，在凝胶成像系统上检测并拍照，如 果存当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测梨黑斑病菌的PCR引物，包括上游引物序列LiA‑F，下游引物序列LiA‑R如下：LiA‑F:5’‑CCGCATCCTGCCCAGTTA‑3’,LiA‑R:5’‑GGTAACTTACTCGTCGCTA‑3’所述引物的大小为254bp。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈雪娇，李云飞，宗凯，姚剑，孙娟娟，郑海松，
申请(专利权)人：安徽出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：安徽;34
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