用于生物分子检测的催化性核酸和金纳米粒子制造技术

本发明专利技术涉及催化性核酸分子信号扩增，其与金纳米粒子的表面等离子体特性相结合以实现生物靶标的简单且灵敏的比色检测。本发明专利技术的试验具有约50 pM灵敏度而不需要纯化步骤，能够并行检测多种靶标，并且容易适合于新的靶标。本发明专利技术的方法能够快速检测淋病、梅毒、疟疾和乙型肝炎感染的遗传靶标。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开涉及生物分子检测领域。更具体地，本专利技术涉及使用催化性核酸分子和金 纳米粒子检测样品中革E (target)生物分子的方法。
技术介绍
简单的、具有成本效益的、灵敏的和特异的照护现场（point-of-care，P0C)诊断学 的开发代表了 21世纪的重大挑战。感染性疾病的传播造成了全球经济和生活的巨大 损失。控制疾病的传播的方法是早期在P0C检测病原体，以及施行适当的治疗或隔离。 作为生物标记物的DNA的检测是目前广泛使用的病原检测的技术。实时荧光定量核酸 扩增检测系统（qPCR)是精选的方法，因为它包括酶信号扩增（amplification)步骤以实现 遗传革G标（genetic target)的高度灵敏和特异性检测。然而，qPCR需要昂贵的设备和 受过高级训练的人员，限制了对于医学实验室的技术使用。强烈需要开发更便宜且更简单 的用于检测DNA靶标和/或其它生物靶标的方法。 DNA酶（DNAzyme)是一种合成的DNA酶（DNAenzyme)，其能够催化另一种核酸分子 的裂解（cheavage)。由于利用了多个代谢回转（turnover)来进行催化，所以DNA酶 将酶扩增步骤引入到实验设置中。该扩增不需要昂贵的且具有低热和储存稳定性的蛋 白质成分而进行。虽然最初设计用来检测Pb2+和其它二价阳离子，但已经报导了 允许DNA酶检测生物分子靶标的若干修改。使用两种主要的方法来实施遗传 革巴标的检测。第一种方法利用类过氧化物酶的DNA酶（peroxidase-mimicking DNAzyme)的 竞争性活化，该类过氧化物酶的DNA酶能够促进比色或化学发光产物的产生。在第二 种更灵敏的方法中，多个团队遵循相似的策略通过将DNA酶分裂成无活性的成分以实施遗 传靶标的检测，该无活性的成分能够通过靶标结合而再活化。然而，这些 研究利用荧光作为读数（readout)，该读数对于P0C应用不是最佳的检测模式，因为它需要 使用相当复杂的荧光计装置。已经报导了一种可供选择的利用金纳米粒子（GNP)的比色读 数的方法用于金属离子、腺苷和可卡因的检测。GNP吸收光的波长 取决于它们是处于单分散还是聚集状态。由于处于单分散或聚集状态的GNP溶液以 它们各自的红色或紫色是容易辨识的，所以这种方法提供了能够肉眼可视的清楚的比色结 果。 照此，专利技术的目的是通过将DNA酶技术与GNP结合以策划能够用于远程设置的简单的 照护现场诊断平台，以克服上述限制。 专利技术的进一步和其它目的将会从下面的
技术实现思路
、专利技术讨论及其实施方案和实施 例得以了解。
技术实现思路
本专利技术涉及扩增金纳米粒子的表面等离子体与DNA酶信号扩增技术结合的比色 偶合（coupling)，以策划具有简单的比色读数的用于遗传靶标的快速且简单的检测平台。 本公开的创造性包括这两种用于生物靶标的检测的新兴技术的融合，其可以用于感染性疾 病靶标的照护现场分析。 照此，在一个实施方案中，本专利技术提供一种检测样品中生物靶标的存在的方法。 在一个实施方案中，该方法包括：(a)将所述样品与下列项接触：Q)未催化的核酸底物 (substrate)，（ii)催化性核酸，所述催化性核酸经配置以在所述祀标的存在下单独地催化 所述底物，及（iii) GNP，所述GNP用连接部分官能化，以与所述未催化的核酸底物组装；以 及（b)分析所述样品以确定所述GNP是处于实质上分散的形式还是处于与所述未催化的 核酸底物组装的形式，其中所述GNP处于实质上分散的形式表明所述靶标存在于所述样品 中。 在用于检测样品中生物靶标的方法的一个实施方案中，在合适的温度下在足量时 间内首先将（i)和（ii)添加到所述样品中，然后将（iii)添加到所述样品中。 在用于检测样品中生物靶标的方法的另一个实施方案中，所述催化性核酸以预催 化性核酸亚单位形式提供，每个预催化性核酸亚单位包括经配置以结合到所述靶标的至少 部分上的传感器域（sensor domain)，及当所述祀标结合到所述传感器域上时单独地催化 所述未催化的核酸底物的催化域（catalytic domain)。 在用于检测样品中生物靶标的方法的另一个实施方案中，所述GNP用核酸链官能 化，该核酸链与用于组装的所述未催化的核酸底物的3'末端和5'末端杂交。 在用于检测样品中生物靶标的方法的另一个实施方案中，在所述组装的形式下， 所述GNP将所述样品变成第一颜色，且在所述实质上分散的形式下，所述GNP将样品变成第 二颜色，并且其中所述方法的步骤（b)包括确定所述样品的颜色。检测到第二颜色表明所 述样品中靶标的存在。 在用于检测样品中生物靶标的方法的另一个实施方案中，所述未催化的核酸底 物、所述催化性核酸和所述GNP经官能化而成为祀特异性的（target specific)。 在一个实施方案中，本专利技术提供一种同时检测样品中关注的多种不同生物靶标的 存在的方法。在一个实施方案中，所述方法包括：(a)将怀疑具有多种不同生物靶标的样 品与（i)靶特异性的未催化的核酸底物和（ii)靶特异性的催化性核酸的靶特异性的组 (sets)混合，在每个靶特异性的组中的所述催化性核酸经配置以在靶标的存在下单独地催 化所述未催化的底物；(b)将步骤（a)的混合物与单独的祀特异性的GNP群（populations) 接触，在每个靶特异性的群中的所述GNP用连接部分官能化，以与其相应的靶特异性的未 催化的核酸底物组装；及（c)对于每个单独的靶特异性的GNP群，确定所述靶特异性的GNP 是否处于与所述相应的靶特异性的未催化的底物组装的形式或处于实质上分散的形式，其 中在一个群中所述靶特异性的GNP处于实质上分散的形式表明相应于本靶特异性的GNP群 的所述靶标存在于所述样品中。 在同时检测样品中关注的多种不同生物靶标的存在的方法的一个实施方案中，所 述催化性核酸以预催化性核酸亚单位形式提供，每个预催化性核酸亚单位包括用于特异性 结合到所述多种不同靶标中的一种上的传感器域，及经配置以当相应的靶标与传感器臂 (sensor arm)结合时单独地催化其相应的祀特异性的未催化的核酸底物的催化域。 在本专利技术的同时检测样品中关注的多种不同生物靶标的存在的方法的另一个实 施方案中，在组装的形式下，所述GNP将所述样品变成第一颜色，且在实质上分散的形式 下，所述GNP将所述样品变成第二颜色，并且其中所述方法的步骤（c)包括对于每个GNP 群，确定所述样品的颜色。在一个GNP群中检测到所述第二颜色表明在所述样品中本GNP 群的所述靶标的存在。 在任何前面的实施方案的方法的一个实施方案中，所述方法进一步包括将所述样 品滴到薄层色谱（TLC)板上，用于视觉检测。在本实施方案的一个方面，所述方法进一步包 括储存所述TLC，用于以后查看。 在任何前面的实施方案的方法的另一个实施方案中，所述方法进一步包括峰值吸 光度（peak absorbance)的紫外-可见光谱位移（shift)的光谱测量。 在任何前面的实施方案的方法的另一个实施方案中，所述催化性核酸和所述未催 化的核酸底物以冻干的混合物形式提供。 在任何前面的实施方案的方法的另一个实施方案中，所述催化性核酸、所述未催 化的核酸底物和所述GN本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测样品中生物靶标的存在的方法，其特征在于，所述方法包括：(a) 将所述样品与下列项接触：(i) 未催化的核酸底物，(ii) 催化性核酸，所述催化性核酸经配置以在所述靶标的存在下单独地催化所述底物，及(iii) 金纳米粒子（GNP），GNP用连接部分官能化，以与所述未催化的核酸底物组装；以及(b) 分析所述样品以确定所述GNP是处于实质上分散的形式还是处于与所述未催化的核酸底物组装的形式，其中所述GNP处于实质上分散的形式表明所述靶标存在于所述样品中。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：沃伦·切·沃·陈，基里洛·扎戈洛夫斯基，
申请(专利权)人：多伦多大学理事会，
类型：发明
国别省市：加拿大;CA