用于抑制松材线虫基因表达的成套试剂与方法技术

本发明专利技术公开了用于抑制松材线虫基因表达的成套试剂与方法。本发明专利技术公开的成套试剂为成套试剂1和成套试剂2，成套试剂1由成套试剂A与降低hsp基因表达的核酸分子组成，成套试剂A由pDE3dBH.qa载体、粗糙脉孢菌dcl‑1

【技术实现步骤摘要】
用于抑制松材线虫基因表达的成套试剂与方法
本专利技术涉及生物
中，用于抑制松材线虫基因表达的成套试剂与方法。
技术介绍
松材线虫是国内外检疫性病原物，随着其大范围的传播，对我国松林造成严重威胁。RNA干扰技术(RNAi)在植物寄生线虫基因功能的研究中得到广泛应用，在应用RNAi技术研究松材线虫基因功能时以浸泡法较为普遍，但其成本昂贵，且不能连续干扰。目前急需一种简单的干扰松材线虫基因表达的方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何降低松材线虫靶标基因的表达以及如何降低松材线虫高温敏感性和抑制松材线虫运动活性。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了可用于降低松材线虫高温敏感性或降低松材线虫hsp基因的表达的成套试剂，将该成套试剂命名为成套试剂1。本专利技术所提供的成套试剂1，由成套试剂A与hsp基因片段组成；所述成套试剂A包括pDE3dBH.qa载体和粗糙脉孢菌；所述hsp基因片段为名称为hsp-AC和/或hsp-BC的核酸分子；所述hsp-AC为如下a1)-a3)中任一种：a1)序列表中序列1的第7-425位所示的cDNA分子或DNA分子；a2)与a1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子；a3)在严格条件下与a1)限定的核苷酸序列杂交，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子；所述hsp-BC为如下b1)-b3)中任一种：b1)序列表中序列2的第7-285位所示的cDNA分子或DNA分子；b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子；b3)在严格条件下与b1)限定的核苷酸序列杂交，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子。上述成套试剂1中，所述成套试剂A还可包括pBT6质粒。上述成套试剂1中，所述成套试剂A可仅由所述pDE3dBH.qa载体和所述粗糙脉孢菌组成，也可由所述pDE3dBH.qa载体、所述粗糙脉孢菌和所述pBT6质粒组成。上述成套试剂1中，所述粗糙脉孢菌可为粗糙脉孢菌株dcl-1-/dcl-2-。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了可用于抑制松材线虫运动活性或降低松材线虫cyc基因或tmy基因的表达的成套试剂，将该成套试剂命名为成套试剂2。本专利技术所提供的成套试剂2，为成套试剂甲或成套试剂乙；所述成套试剂甲由所述成套试剂A与cyc基因片段组成；所述cyc基因片段为名称为cyc-AC和/或cyc-BC的核酸分子；所述cyc-AC为如下c1)-c3)中任一种：c1)序列表中序列3的第7-334位所示的cDNA分子或DNA分子；c2)与c1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子；c3)在严格条件下与c1)限定的核苷酸序列杂交，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子；所述cyc-BC为如下d1)-d3)中任一种：d1)序列表中序列4的第7-224位所示的cDNA分子或DNA分子；d2)与d1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子；d3)在严格条件下与d1)限定的核苷酸序列杂交，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子；所述成套试剂乙由所述成套试剂A与tmy基因片段组成；所述tmy基因片段为名称为cyc-AC和/或cyc-BC的核酸分子；所述tmy-AC为如下e1)-e3)中任一种：e1)序列表中序列5的第7-377位所示的cDNA分子或DNA分子；e2)与e1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子；e3)在严格条件下与e1)限定的核苷酸序列杂交，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子；所述tmy-BC为如下f1)-f3)中任一种：f1)序列表中序列6的第7-236位所示的cDNA分子或DNA分子；f2)与f1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子；f3)在严格条件下与f1)限定的核苷酸序列杂交，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了所述成套试剂A或所述hsp基因片段或所述cyc基因片段或所述tmy基因片段。所述成套试剂A可用于降低松材线虫靶标基因的表达。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了抑制松材线虫靶标基因表达的方法。本专利技术所提供的抑制松材线虫靶标基因表达的方法，包括：将降低靶标基因表达的核酸分子导入所述pDE3dBH.qa载体，得到重组载体，将所述重组载体导入所述粗糙脉孢菌，得到重组菌；利用所述重组菌处理松材线虫，得到所述靶标基因表达降低的松材线虫。上述方法中，所述重组菌还可含有pBT6质粒。上述方法中，所述降低靶标基因表达的核酸分子可为所述靶标基因的全长或任意片段或其两个任意片段的组合。上述方法中，所述靶标基因为hsp基因；所述降低靶标基因表达的核酸分子可为所述hsp基因片段。所述靶标基因为cyc基因；所述降低靶标基因表达的核酸分子可为所述cyc基因片段。所述靶标基因为tmy基因；所述降低靶标基因表达的核酸分子可为所述tmy基因片段。上述方法中，所述利用所述重组菌处理松材线虫可为通过喂食所述松材线虫所述重组菌实现。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了下述任一应用：X1、所述成套试剂A或所述成套试剂1或所述成套试剂2在抑制松材线虫基因表达中的应用；X2、所述成套试剂1在降低松材线虫高温敏感性中的应用；X3、所述成套试剂2在抑制松材线虫运动活性中的应用。本专利技术中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本专利技术的序列1的第7-425位、序列2的第7-285位、序列3的第7-334位、序列4的第7-224位、序列5的第7-377位和序列6的第7-236位的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。实验证明，利用本专利技术的成套试剂与方法可以成功抑制松材线虫靶标基因(hsp、tmy和cyc基因)的表达，进一步可以降低其抗高温敏感性和抑制其运动活性：喂食通过pDE3dBH.qa载体导入hsp基因片段得到的重组粗糙脉孢菌(dcl-1-/dcl-2--pDE3dBH.qa-hsp)的松材线虫中hsp基因的表达量、喂食通过pDE3dBH.qa载体导入cyc基因片段得到的重组粗糙脉孢菌(dcl-1-/dcl-2--pDE3dBH.qa-cyc)的松材线虫中cyc基因的表达量和喂食通过pDE3本文档来自技高网...

【技术保护点】
名称为成套试剂1的成套试剂，由成套试剂A与hsp基因片段组成；所述成套试剂A包括pDE3dBH.qa载体和粗糙脉孢菌；所述hsp基因片段为名称为hsp‑AC和/或hsp‑BC的核酸分子；所述hsp‑AC为如下a1)‑a3)中任一种：a1)序列表中序列1的第7‑425位所示的cDNA分子或DNA分子；a2)与a1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子；a3)在严格条件下与a1)限定的核苷酸序列杂交，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子；所述hsp‑BC为如下b1)‑b3)中任一种：b1)序列表中序列2的第7‑285位所示的cDNA分子或DNA分子；b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子；b3)在严格条件下与b1)限定的核苷酸序列杂交，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子。

【技术特征摘要】
1.名称为成套试剂1的成套试剂，由成套试剂A与hsp基因片段组成；所述成套试剂A包括pDE3dBH.qa载体和粗糙脉孢菌；所述hsp基因片段为名称为hsp-AC和/或hsp-BC的核酸分子；所述hsp-AC为如下a1)-a3)中任一种：a1)序列表中序列1的第7-425位所示的cDNA分子或DNA分子；a2)与a1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子；a3)在严格条件下与a1)限定的核苷酸序列杂交，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子；所述hsp-BC为如下b1)-b3)中任一种：b1)序列表中序列2的第7-285位所示的cDNA分子或DNA分子；b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子；b3)在严格条件下与b1)限定的核苷酸序列杂交，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子。2.根据权利要求1所述的成套试剂，其特征在于：所述成套试剂A还包括pBT6质粒。3.根据权利要求1或2所述的成套试剂，其特征在于：所述粗糙脉孢菌为粗糙脉孢菌株dcl-1-/dcl-2-。4.名称为成套试剂2的成套试剂，为成套试剂甲或成套试剂乙；所述成套试剂甲由权利要求1-3中任一所述成套试剂A与cyc基因片段组成；所述cyc基因片段为名称为cyc-AC和/或cyc-BC的核酸分子；所述cyc-AC为如下c1)-c3)中任一种：c1)序列表中序列3的第7-334位所示的cDNA分子或DNA分子；c2)与c1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子；c3)在严格条件下与c1)限定的核苷酸序列杂交，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子；所述cyc-BC为如下d1)-d3)中任一种：d1)序列表中序列4的第7-224位所示的cDNA分子或DNA分子；d2)与d1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子；d3)在严格条件下与d1)限定的核苷酸序列杂交，且具有相同功能的cDNA分子或DNA分子；所述成套试剂乙由权利要求1-3中任一所述成...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘倩，简恒，王梦，陈永攀，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11