用于抑制α‑1抗胰蛋白酶基因表达的组合物及方法技术

本发明专利技术关于一种经由RNA干扰机制来抑制AAT基因表达的RNA干扰触发物。本发明专利技术还关于一种药物组合物，其包含该AAT RNAi触发物以及能够改良该RNAi触发物在体内向肝细胞递送的赋形剂。该AAT RNAi触发物在体内向肝细胞的递送使得AAT基因表达得到抑制且使α1‑抗胰蛋白酶缺陷及相关疾病得到治疗。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
α-1抗胰蛋白酶缺陷是一种遗传性常染色体共显性基因病症，其导致α1-抗胰蛋白酶(A1AT)产生不足，从而引起肺病及肝病且发病频率为每1,500至3,500位个体中约有1例。α-1抗胰蛋白酶缺陷最通常会影响全世界具有欧洲血统的人。α-1抗胰蛋白酶(α1-抗胰蛋白酶、α-1蛋白酶抑制剂、A1AT或AAT)是属于丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(serpin)超家族的蛋白酶抑制剂。正常的AAT蛋白主要在肝中由肝细胞合成且分泌至血液中。其生理学功能为抑制嗜中性粒细胞蛋白酶(neutrophilprotease)以保护宿主组织以免在炎性阶段受到非特异性损伤。A1AT缺陷(AATD)在临床上最重要的形式由Z突变引起。Z突变型等位基因(PiZ)经由单一点突变使得突变型PiZ蛋白倾向于在肝细胞内质网中异常折叠，从而导致细胞内滞留。循环性蛋白酶活性丧失使得肺易受嗜中性粒细胞弹性蛋白酶所致的损伤，从而导致肺气肿发展。每周使用纯化人AAT来对AATD进行AAT增强治疗得到正常的AAT血浆水平，且预防受影响个体的肺损伤。尽管给予纯化AAT能缓解由内源分泌AAT丧失所引起的肺损伤，但AATD患者仍易患由过量异常折叠AAT蛋白的蓄积所引起的内质网肝贮积病。12％至15％的AATD患者还发生肝病，其可能严重或致命、甚至于在婴儿期发生。在AATD患者中，AAT蛋白在肝细胞中的细胞内累积会诱导肝细胞损伤及死亡，以及慢性肝损伤。临床表现包括慢性肝炎、肝硬化、肝细胞癌、转氨酶升高(transaminitis)、胆汁郁积、纤维化及甚至暴发性肝衰竭。目前不存在用于防止由AATD所致的肝病发作或减缓其进展的特定治疗。因为由AATD造成的肝损伤经由功能获得机制发生，所以抑制或AAT基因表达将适用于防止AAT蛋白在肝中累积，藉此提供对AATD的治疗性治疗。已经显示双链RNA分子(dsRNA)及其他RNAi触发物会以高度保守的调控机制阻断基因表达，其称为RNA干扰(RNAi)。本专利技术提供用于抑制AAT基因体内表达的AATRNA干扰(RNAi)触发物及其组合物。本专利技术亦提供使用AATRNAi触发物以治疗AATD及由AATD引起的病状及疾病(诸如慢性肝炎、肝硬化、肝细胞癌及暴发性肝衰竭)的方法。专利技术概述本专利技术提供能够选择性地且有效地减少AAT表达的α-1抗胰蛋白酶(AAT)基因特异性RNA干扰(RNAi)触发分子。使用AATRNAi触发物提供一种用于治疗性治疗与α-1抗胰蛋白酶缺陷相关的疾病的方法。此类方法包括向人类或动物给予靶向AAT的RNAi触发物。在一个实施方式中，本专利技术提供用于抑制人类AAT基因表达的RNAi触发分子。该RNAi触发物包含至少两个相互部分、实质上或完全互补的序列。在一个实施方式中，两个RNAi触发物序列含有包含第一序列的正义链及包含第二序列的反义链。在另一实施方式中，两个RNAi触发物序列包含两条共同包含第一序列的正义链，及包含第二序列的反义链，其中正义链与反义链一起形成部分双链体(meroduplex)(表2及表4)。AATRNAi触发物正义链包含与AATmRNA至少一部分具有至少90％相同性的序列。表1至表5中展示示例性AATRNAi触发物正义链、反义链、序列对及部分双链体。在一个实施方式中，反义链包含与由该AAT基因编码的mRNA的一部分互补的核苷酸序列，且互补区域的长度最佳小于30个核苷酸。此外，较佳的是，本文所述的本专利技术RNAi触发物的长度(双链体长度)在约16至30个核苷酸的范围内，尤其在约18至28个核苷酸的范围内。尤其适用于本专利技术上下文的是约17、18、19、20、21、22、23或24个核苷酸的双链体长度。正义链与反义链可具有相同长度或其可具有不同长度。例如，正义链与反义链的长度均可为19、20、21、22、23或24个核苷酸。举例而言，正义链的长度可为21个核苷酸，而反义链的长度为23个核苷酸。19、21、22或23个核苷酸的双链体段为最佳。RNAi触发物在递送至表达AAT基因的细胞时会抑制该AAT基因的体外或体内表达。根据需要局部还是全身治疗以及待治疗的区域，可用许多方式给予本文所述的RNAi触发分子或药物组合物。给予可为局部的(例如藉由经皮贴片)、经肺，例如藉由吸入或吹入粉末或气溶胶，包括藉由喷雾器：气管内、鼻内、经表皮及经皮、经口或非经肠。非经肠给药包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内、肌肉内注射或输注；皮下，例如经由植入式装置；或颅内，例如脑实质内、鞘内或脑室内给药。可使用本领域中所知的任何已知寡核苷酸递送技术将本文所述的RNAi触发分子递送至目标细胞或组织。核酸递送方法包括(但不限于)封装于脂质体中、藉由离子电渗或藉由掺入其他载剂，诸如水凝胶、环糊精、可生物降解的纳米胶囊，及生物黏性微球粒、蛋白性载体或DPC(WO2000/053722、WO2008/0022309、WO2011/104169及WO2012/083185，其各自以引用的方式并入本文中)。在一个实施方式中，AATRNAi触发物与体内递送化合物一起提供。较佳的体内递送化合物包括MLP递送聚合物。在另一较佳实施方式中，本专利技术的特征在于将AATRNAi触发物体内递送至肝细胞的组合物，其包含：本文所述的AATRNAi触发物，其偶联于含有至少20个碳原子的疏水基团诸如胆固醇(RNA触发物-偶联物)。附图说明图1.表1.靶向AATmRNA的RNAi触发物的核心序列。图2.表2.含有5'及3'延伸的RNAi触发序列。大写字母表示核糖核苷酸，小写字母“c”“g”“a”及“u”表示2'O-甲基修饰的核苷酸，后接有“f”的大写字母A、C、G、U表示2'-氟代核苷酸，“s”表示硫代磷酸酯，“dT”表示脱氧胸苷，(invdT)表示反向脱氧胸苷(3'-3'-连接)。图3.表3.规范的(canonical)AATsiRNARNAi触发物。大写字母表示RNA核苷酸，小写字母“c”“g”“a”及“u”表示2'O-甲基修饰的核苷酸，后接有“f”的大写字母A、C、G、U表示2'-氟代核苷酸，“s”表示硫代磷酸酯，“dT”表示脱氧胸苷，且(invdT)表示反向脱氧胸苷(3'-3'-连接)。Tm为RNAi触发物的解链温度。图4.表4.AAT部分双链体RNAi触发物。大写字母表示RNA核苷酸，小写字母“c”“g”“a”及“u”表示2'O-甲基修饰的核苷酸，后接有“f”的大写字母A、C、G、U表示2'-氟代核苷酸，“s”表示硫代磷酸酯，“dT”表示脱氧胸苷，且(invdT)表示反向脱氧胸苷(3'-3'-连接)。Tm为RNAi触发物的解链温度。图5.表5.AATUNARNAi触发物。大写字母表示RNA核苷酸，小写字母“c”“g”“a”及“u”表示2'O-甲基修饰的核苷酸，后接有“f”的大写字母A、C、G、U表示2'-氟代核苷酸，后接有“UNA”的大写字母A、C、G、U表示2',3'-断(解锁)RNA核苷酸模拟物，“s”表示硫代磷酸酯，“dT”表示脱氧胸苷，且(invdT)表示反向脱氧胸苷(3'-3'-连接)。Tm为RNAi触发物的解链温度。图6A-E.适用于体内递送本文所述的AATRNAi触发物的MLP聚合物的列表。图7.描绘使用不同浓度的所示RNAi触发物在体外H本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种RNA干扰(RNAi)触发分子，其能够抑制α‑1抗胰蛋白酶基因的表达，其中所述RNAi触发分子包含正义序列及反义序列，其中所述反义序列依次包含SEQ ID No.1、2、3、4或5的核苷酸1‑18。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.06.17 US 62/013,2881.一种RNA干扰(RNAi)触发分子，其能够抑制α-1抗胰蛋白酶基因的表达，其中所述RNAi触发分子包含正义序列及反义序列，其中所述反义序列依次包含SEQIDNo.1、2、3、4或5的核苷酸1-18。2.如权利要求1所述的RNAi触发分子，其中所述正义链或反义链进一步包含长度为1至5个核苷酸的3'延伸。3.如权利要求2所述的RNAi触发分子，其中所述反义链的3'延伸包含dTdT或dTsdT。4.如权利要求2所述的RNAi触发分子，其中所述正义链的3'延伸包含Af(invdT)。5.如权利要求1所述的RNAi触发分子，其中所述正义链或反义链进一步包含长度为1至5个核苷酸的5'延伸。6.如权利要求5所述的RNAi触发分子，其中所述反义链的该5'延伸包含dT。7.如权利要求5所述的RNAi触发分子，其中所述正义链的该5'延伸包含UAU或uAu。8.如权利要求1所述的RNAi触发分子，其中靶向部分偶联于所述正义链的5'端。9.如权利要求8所述的RNAi触发分子，其中所述靶向部分包含胆固醇基。10.如权利要求9所述的RNAi触发分子，其中所述靶向部分包含胆固醇-三甘醇基。11.如权利要求1所述的RNAi触发分子，其中所述正义序列与反义序列形成选自下组的序列对：SEQIDNO:1/8、2/9、3/10、4/11或5/12。12.如权利要求2所述的RNAi触发分子，其中所述正义序列与反义序列形成选自下组的序列对或部分双链体：SEQIDNO:15/23、15/24、15/25/41、15/26/42、15/27/43、16/28、16/29/44、17/30、18/31、18/32/45、18/33/46、18/34/47、18/35/48、16/36、19/37/49或19/38。13.如权利要求1所述的RNAi触发分子，其中所述正义链或反义链含有一或多种经修饰...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·I·伍德尔，D·L·路易斯，D·H·维基菲尔德，L·埃尔米达，S·B·坎纳，
申请(专利权)人：箭头药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US