用于抑制ALAS1基因表达的组合物与方法技术

本发明专利技术涉及靶向ALAS1基因的双链核糖核酸(dsRNA)组合物，和使用这类dsRNA组合物来改变(例如，抑制)ALAS1的表达的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请本申请要求2013年10月4日提交的美国临时申请号61/887288以及2014年4月24日提交的美国临时申请号61/983720的优先权。前述申请的每个的全部内容特此通过引用结合在此。序列表本申请包含已经以电子方式以ASCII格式提交并且特此通过引用以其全文结合的序列表。创建于2014年10月2日的所述ASCII拷贝被命名为A2038-7202WO_SL.txt，大小为1,107,486字节。专利
本专利技术涉及特异性抑制ALAS1基因的表达。专利技术背景遗传性卟啉症是血红素生物合成途径(在此还称作卟啉途径)中特异性酶的活性缺乏导致的一类失调。卟啉途径中酶的缺乏导致血红素的不充分生产并且导致卟啉前体和卟啉的累积，高浓度的卟啉前体和卟啉对组织是有毒的。遗传性卟啉症中，急性间歇性卟啉症(AIP，例如，常染色体显性AIP)、杂斑卟啉症(variegate porphyria，VP，例如，常染色体显性VP)、遗传性粪卟啉症(粪卟啉症或HCP，例如，常染色体显性HCP)、以及5’氨基乙酰丙酸(还称作δ-氨基乙酰丙酸或ALA)脱水酶缺乏性卟啉症(ADP，例如，常染色体隐性ADP)被分类为急性肝性卟啉症并且表现为可能危及生命的急性神经性发作。这些急性发作特征是自主神经、外周神经和中枢神经症状，包括急性腹痛、高血压、心动过速、便秘、运动无力、瘫痪、以及抽搐。如果治疗不得当，接着可能发生四肢瘫痪、呼吸道受损、以及死亡。多种因素，包括细胞色素P450-诱导药物、饮食、以及激素变化可能通过增加肝5’-氨基乙酰丙酸合酶1(ALAS1，血红素生物合成途径的第一以及限速酶)的活性促成急性发作。在急性卟啉症，例如，AIP、VP、HCP以及ADP中，各自的酶缺乏导致肝产生并累积一种或多种物质(例如，卟啉和/或卟啉前体，例如，ALA和/或PBG)，这种或这些物质可能是神经毒的并且可能导致发生急性发作。参见，例如，巴望尼(Balwani,M)和戴斯尼克(Desnick,R.J.)，血液(Blood)，120:4496-4504，2012。目前用于急性神经性发作的疗法是静脉给药氯化血红素(灵北公司(Lundbeck)或科懋公司(Orphan Europe))，这为ALAS1的负反馈抑制提供了外源血红素，并且由此降低了ALA和PBG产生。氯化血红素用于在急性发作期间进行治疗或用于预防发作，特别是对于患有急性卟啉症并在她们的月经周期中伴随激素变化经历频繁发作的女性。虽然患者总体上响应良好，但是它的效果缓慢，典型地花费二到四天或更久来使得ALA和PBG浓度朝向正常水平归一化。因为静脉内氯化血红素代谢迅速，通常需要三至四次输注以有效治疗或预防急性发作。此外，重复输注可能导致铁超负荷以及静脉炎，这可能危害外周静脉通路。尽管通过原位肝移植可治愈，这一手术具有显著的发病率和死亡率并且可用的肝供体是受限的。因此，需要更有效、作用快速且安全的替代性治疗方案。如果此类治疗可以通过皮下给药而递送，将是特别有益的，因为这将排除对输注和旷日持久的住院治疗的需求。AIP，还称作胆色素原脱氨酶(PBGD)缺乏，或羟甲基胆色烷合酶(HMBS)缺乏，是最常见的急性肝性卟啉症。AIP的患病率估计为100,000人中5-10人，其中5％-10％患者是有症状的。AIP是由HMBS基因突变引起的一种常染色体显性失调，这一突变将导致该酶的活性降低，例如，正常活性的一半。预先通过同源重组产生具有约30％野生型HMBS活性的AIP小鼠模型。如同人类患者一样，当给予生卟啉药(porphyrinogenic drugs)，如苯巴比妥时，这些小鼠增加肝ALAS1活性并且累积大量的血浆和尿ALA与PBG。因此，将它们用作对用于急性肝性卟啉症的新颖疗法的效力进行评估的优异模型。专利技术概述本专利技术描述了用于调节ALAS1基因表达的方法和iRNA组合物。在某些实施例中，使用ALAS1-特异性iRNA降低或抑制ALAS1基因的表达。这样的抑制可以有用于治疗与ALAS1表达相关的失调，如卟啉症。因此，在此描述的是多种组合物和方法，如在细胞或在受试者中(例如，在哺乳动物如人类受试者中)，实现ALAS1基因RNA转录本的RNA-诱导的沉默复合体(RISC)-介导的切割。还描述了多种组合物和方法，用于治疗与ALAS1基因的表达相关的失调，像卟啉症，例如，X-连锁的铁粒幼细胞贫血(XLSA)、ALA脱水酶缺乏卟啉症(Doss卟啉症或ADP)、急性间歇性卟啉症(AIP)、先天性红细胞生成性卟啉症(CEP)、迟发性皮肤卟啉症(PCT)、遗传性粪卟啉症(粪卟啉症、或HCP)、杂斑卟啉症(VP)、红细胞生成性原卟啉症(EPP)、或婴儿暂时性红细胞卟啉症。在一些实施例中，该失调是急性肝性卟啉症，例如，ALA脱水酶缺乏卟啉症(ADP)、AIP、HCP、或VP。在某些实施例中，该失调是ALA脱水酶缺乏卟啉症(ADP)或AIP。在实施例中，该卟啉症是肝性卟啉症，例如，是选自以下各项的卟啉症：急性间歇性卟啉症(AIP)遗传性粪卟啉症(HCP)、杂斑卟啉症(VP)、ALA脱水酶缺乏卟啉症(ADP)、和肝性红细胞生成性卟啉症。在实施例中，卟啉症是纯合的显性肝性卟啉症(例如，纯合的显性AIP、HCP、或VP)或肝性红细胞生成性卟啉症。在实施例中，卟啉症是双卟啉症。如在此使用的，术语“iRNA”、“RNAi”、“iRNA剂”、“RNAi剂”、或“iRNA分子”是指包含如在此定义的术语RNA的一种药剂，并且其例如经由RNA-诱导的沉默复合物(RISC)路径介导RNA转录物的靶向切割。在一个实施例中，如在此所述的iRNA实现ALAS1在细胞或哺乳动物中表达的抑制。包含在在此表征的组合物中的iRNA包含具有RNA链(反义链)的dsRNA，该RNA链具有一个区域，例如，该区域是30个或更少个核苷酸，通常是19-24个核苷酸的长度，该区域基本上与ALAS1基因(例如，小鼠或人ALAS1基因)的mRNA转录本(在此还称作“ALAS1-特异性iRNA”)的至少一部分互补。可替代地，或组合地，iRNAs包含具有RNA链(反义链)的dsRNA，该RNA链具有一个区域，该区域是30个或更少个核苷酸，通常是19-24个核苷酸的长度，该区域基本上与ALAS1基因(例如，人ALAS1基因的变体1或2)的mRNA转录本的至少一部分互补(在此还称作“ALAS1-特异性iRNA”)。在实施例中，在此描述的iRNA(例如dsRNA)包括一个反义链，该反义链具有基本上与人ALAS1的一个区域互补的一个区域。在实施例中，人ALAS1具有序列NM_000688.4(SEQ ID NO:1)或NM_000688.5(SEQ ID NO:382)。在实施例中，该人类ALAS1具有NM_199166.1的序列。在实施例中，iRNA(例如，dsRNA)的反义序列靶向ALAS1转录物NM_000688.4上的区域871至895(在5’和/或3’端上，以单向或双向，加或减5、4、3、2、或1个核苷酸)内。在实施例中，该反义序列靶向ALAS1转录物NM_000688.4上的核苷酸871至893、871至892、或873至895。在实施例中，该反义序列包括与ALAS本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于抑制ALAS1的表达的双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包括有义链和反义链，该反义链包括与ALAS1 RNA转录物(例如，SEQ ID NO:1)互补的区域，该反义链包括来自具有UAAGAUGAGACACUCUUUCUGGU(SEQ ID NO:4153)或UAAGAUGAGACACUCTUUCUGGU(SEQ ID NO:4154)的反义序列的至少20个连续核苷酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.10.04 US 61/887,288;2014.04.24 US 61/983,7201.一种用于抑制ALAS1的表达的双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包括有义链和反义链，该反义链包括与ALAS1 RNA转录物(例如，SEQ ID NO:1)互补的区域，该反义链包括来自具有UAAGAUGAGACACUCUUUCUGGU(SEQ ID NO:4153)或UAAGAUGAGACACUCTUUCUGGU(SEQ ID NO:4154)的反义序列的至少20个连续核苷酸。2.一种用于抑制ALAS1的表达的双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包括有义链和反义链，该反义链包括与ALAS1 RNA转录物(例如，SEQ ID NO:1)互补的区域，该反义链包括来自以下项的至少20个连续核苷酸：(i)表21至表40中任一项中列出的反义序列，或(ii)表21至表40中任一项中列出的反义序列的未修饰版(SEQ ID NO:4172至5237)。3.如权利要求2所述的dsRNA，其中所述dsRNA包括至少一个修饰的核苷酸。4.如前述权利要求中任一项所述的dsRNA，其中该双链体区域长度是17-23个核苷酸对。5.如前述权利要求中任一项所述的dsRNA，其中至少一条链包括具有至少2个核苷酸的3’突出端。6.如前述权利要求中任一项所述的dsRNA，其中每条链长度是不多于26个核苷酸。7.如权利要求3所述的dsRNA，其中至少一个修饰的核苷酸选自2′-O-甲基、2′-氟修饰的核苷酸，以及任选地一个或多个5’-硫代磷酸酯基团，或其任何组合。8.如前述权利要求中任一项所述的dsRNA，进一步包括配体，任选地其中该配体共轭至该dsRNA的有义链的3’端。9.如权利要求8所述的dsRNA，其中该配体包括碳水化物，任选地其中该配体是GalNAc配体。10.如权利要求9所述的dsRNA，其中该配体是11.如权利要求8-10中任一项所述的dsRNA，其中该配体是经由二价或三价分支接头而附接。12.如权利要求11所述的dsRNA，其中该配体和接头是如式XXIV所示的：13.如权利要求8所述的dsRNA，其中该dsRNA经由如以下所示的接头共轭至配体L9614.如权利要求8至13中任一项所述的dsRNA，其中该配体将该dsRNA靶向肝实质细胞。15.如前述权利要求中任一项所述的dsRNA，其中该dsRNA包括有义链和反义链，该有义链由有义序列组成，该有义序列选自表21至表40中所列出的有义序列，该反义链由反义序列组成，该反义序列选自表21至表40中所列出的反义序列。16.如前述权利要求中任一项所述的dsRNA，其中该dsRNA具有低于1nM、低于0.05nM、低于0.02nM、或低于0.01nM的IC50。17.如前述权利要求中任一项所述的dsRNA，其中该dsRNA具有低于约10mg/kg或低于约5mg/kg的单剂量ED50。18.如前述权利要求中任一项所述的dsRNA，其中该dsRNA与AD-58632或AD-60489相比显示出改进的活性，任选地其中该dsRNA选自表21至表40中列出的dsRNA。19.如前述权利要求中任一项所述的dsRNA，其中该有义链包括CAGAAAGAGUGUCUCAUCUUA(SEQ ID NO:4155)的序列，或由其组成。20.如权利要求1或2所述的dsRNA，其中：(i)该反义链包括AD-60519的反义序列，其中该反义序列包括AD-60519的所有修饰的核苷酸；(ii)该反义链由AD-60519的反义序列组成，其中该反义序列包括AD-60519的所有修饰的核苷酸；(iii)该有义链包括AD-60519的有义序列，其中该有义序列包括AD-60519的所有修饰的核苷酸；(iv)该有义链由AD-60519的有义序列组成，其中该有义序列包括AD-60519的所有修饰的核苷酸；(v)该有义链包括AD-60519的有义序列，并且该反义链包括AD-60519的反义序列，其中该有义和反义序列包括AD-60519的所有修饰的核苷酸，或(vi)该有义链由AD-60519的有义序列组成，并且该反义链由AD-60519的反义序列组成，其中该有义和反义序列包括AD-60519的所有修饰的核苷酸。21.如权利要求1或2所述的dsRNA，其中：(i)该反义链包括AD-60489的反义序列，和/或该有义链包括AD-60489的有义序列，其中该反义和/或有义序列包括AD-60489的所有修饰的核苷酸，或(ii)该反义链由AD-60489的反义序列组成，和/或该有义链由AD-60489的有义序列组成，其中该反义和/或有义序列包括AD-60489的所有修饰的核苷酸。22.如权利要求1或2所述的dsRNA，其中：(i)该反义链包括AD-61193的反义序列，和/或该有义链包括AD-61193的有义序列，其中该反义和/或有义序列包括AD-61193的所有修饰的核苷酸，或(ii)该反义链由AD-61193的反义序列组成，和/或该有义链由AD-61193的有义序列组成，其中该反义和/或有义序列包括AD-61193的所有修饰的核苷酸。23.如权利要求2所述的dsRNA，其中：(i)该反义链包括AD-60819的反义序列，和/或该有义链包括AD-60819的有义序列，其中该反义和/或有义序列包括AD-60819的所有修饰的核苷酸，或(ii)该反义链由AD-60819的反义序列组成，和/或该有义链由AD-60819的有义序列组成，其中该反义和/或有义序列包括AD-60819的所有修饰的核苷酸。24.一种载体，该载体编码如权利要求1至23中任一项所述的dsRNA的至少一条链。25.一种细胞，该细胞包括如权利要求1至23中任一项所述的dsRNA或如权利要求24所述的载体。26.一种用于抑制ALAS1基因表达的药物组合物，该组合物包括如权利要求1至23中任一项所述的dsRNA。27.如权利要求26所述的药物组合物，其中dsRNA在非缓冲盐水或水溶液中进行给予。28.如权利要求26或27所述的药物组合物，其中所述组合物适用于皮下给予。29.一种抑制细胞中ALAS1表达的方法，该方法包括：(a)向该细胞中引入如权利要求1至23中任一项所述的dsRNA，并且(b)维持步骤(a)的细胞一段时间，该时间足以获得ALAS1基因的mRNA转录物的降解，由此抑制该ALAS1基因在该细胞中的表达，任选地其中ALAS1的表达...

【专利技术属性】
技术研发人员：B·贝腾考特，K·菲茨杰拉德，W·奎贝斯，R·J·德斯尼克，M·亚苏达，
申请(专利权)人：阿尔尼拉姆医药品有限公司，西奈山伊坎医学院，
类型：发明
国别省市：美国;US