本发明专利技术提供一种从牛卵巢中提取的牛抑制素α亚基成熟肽基因及其编码的蛋白质，其多核苷酸序列是SEQ ID NO：1，氨基酸序列是SEQ ID NO：2。提供了含有这种牛抑制素α亚基成熟肽基因和pET32a(+)载体的牛抑制素α亚基成熟肽基因的重组表达载体及其构建方法，提供了牛抑制素α亚基成熟肽重组表达蛋白质的诱导和制备方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及基因工程
，具体地说，设及一种牛抑制素a亚基成熟肤基 因，牛祀T32a(+)-ma化巧tide重组载体和祀T32a(+)-ma化巧tide-E.COliBL2UDE3)工程 菌的构建、重组蛋白质的诱导表达方法和纯化方法、W及制备多克隆抗体和免疫性检测的 方法。
技术介绍
超数排卵是胚胎移植的关键技术之一，目前常用的超排药物主要是FSH，但由于超 排是一项复杂的生理过程，加之F甜生产厂家批号不同W及动物个体的差异，致使生产中 FSH超排效果不稳定。同时，由于FSH在体内半衰期较短，需要频繁注射给药。与FSH法超 排相比，采用抑制素免疫进行超排处理不仅提高排卵率，而且提供了更多的可移植胚胎， 同时避免了激素残留问题。 抑制素是一种糖蛋白类激素，主要来源于动物性腺中，自20世纪80年代W来，先 后在许多动物的卵泡液和精液中发现抑制素的存在，并分离成功。目前认为其主要生理功 能是在下丘脑一垂体一性腺轴中起重要的调控作用，反馈性的抑制垂体FSH的释放，调控 动物的生殖活动。近年来，人们利用各种来源的抑制素或人工合成的抑制素片段为免疫原 主动或被动免疫雌性动物，均发现不同程度的提高排卵数和产仔数。抑制素的生理作用是 可W抑制体内FSH合成和分泌，并可通过复杂的反馈调节机制从而调节机体体液水平，从 而对卵巢上卵泡发育起到调控作用。因此，对动物体进行免疫抑制素可W在体内产生抗抑 审懷抗体，从而中和内源性抑制素，使FSH的合成和分泌不受抑制，从而增加血液中FSH的 含量，而且抑制素免疫可W直接阻止排卵前FSH的降解，相对上升了FSH水平，提高排卵数。 现有技术中，重组抑制素试验均诱导出包涵体蛋白，包涵体蛋白在后续试验操作中需要对 蛋白进行复性处理，且复性后的蛋白无天然活性，运大大增加了试验难度与成本。
技术实现思路
本专利技术从牛卵巢中提取牛抑制素成熟肤基因序列，进行载体构建，通过优化诱导 表达抑制素重组可溶性蛋白的最适宜表达条件，使得可溶性蛋白表达量大。此外，本专利技术克 服了现有技术中其他重组抑制素均诱导出包涵体蛋白的缺陷，使得诱导出的可溶性蛋白在 蛋白纯化时不需复性处理，且蛋白构象具有天然活性，运大大降低了技术难度与成本，更有 利于产业化。本专利技术制备的牛抑制素重组a亚基重组蛋白质具有较好的反应原性。本发 明制备的牛抑制素重组a亚基抗体具有较高的免疫原性。 本专利技术的一个目的是提供一种从牛卵巢中提取的牛抑制素a亚基成熟肤基因， 其多核巧酸序列是SEQIDNO:1。并且提供了该基因编码的牛抑制素a亚基成熟肤重组 蛋白质，其氨基酸序列是SEQIDNO:2。 本专利技术的再一个目的是提供一种含有牛抑制素a亚基成熟肤基因的表达载体、 构建该基因表达载体的方法W及利用该表达载体转化的重组基因工程菌。 本专利技术的第=个目的是提供牛抑制素a亚基成熟肤重组表达蛋白质的高效诱导 表达方法、纯化该重组蛋白质的方法。 本专利技术的第四目的是提供牛抑制素a亚基成熟肤重组蛋白在兔体内制备多克隆 抗体、确定最佳免疫剂量及免疫次数的方法。 本专利技术上述专利技术目的是通过下面的技术方案实现的： 一方面，本专利技术从牛卵巢中提取出牛抑制素a亚基成熟肤基因，其多核巧酸序列 是SEQIDNO:1。提供了该基因编码的牛抑制素a亚基成熟肤重组蛋白质，其氨基酸序列 是沈QIDNO:2。 另一方面，本专利技术构建了含有牛抑制素a亚基成熟肤基因的表达载体，其包含由 SEQIDNO:1的405个核巧酸组成的牛抑制素成熟肤基因matP巧tide和祀T32a(+)载体， 该牛Inhibin成熟肤基因matP巧tide位于祀T32a(+)载体的BamHI和化oil限制性内 切酶酶切位点之间。 第=方面，本专利技术提供了一种含有上述牛抑制素成熟肤基因表达载体的构建方 法，包括W下步骤：[001引（1)根据Bostaurusinhibin,alpha(INHA)基因序列用Primer5. 0 软件设计InhibinmatP巧tide编码基因引物，引物序列如下：上游引物：Pl:5,-cgggatcccgctccacgcccccactg-3，（沈QIDNO:3)下游引物：P2 :5，-ccgctcgagaatcccttagatgcaagcaca-3，（沈QIDNO:4) 似提取牛卵巢卵泡周边组织RNA并反转录成cDNA，W此为模板。利用引物Pl和 P2进行PCR扩增。 (3)将步骤（2)扩增得到的RT-PCR产物连接到PMD19-T载体，转化到感受态细胞 宿主菌进行克隆，用菌落PCR方法筛选阳性菌落，用质粒PCR方法筛选阳性重组质粒，测序 结果正确的阳性重组质粒命名为InhibinpMD19-T-matP巧tide质粒；[001引 （4)用限制性内切酶BamHI和)(holI分别对InhibinpMD19-T-matP巧tide质 粒和祀T32a(+)质粒进行双酶切，分别回收Inhibinma化巧tide片段和祀T32a(+)线状载 体；[001引 巧）将Inhibinma化巧tide片段连接到祀T32a(+)线状载体，转化到感受 态宿主菌，用质粒PCR、质粒双酶切筛选阳性重组质粒，得到重组表达载体Inhibin pET32a(+)-matpeptide。 在本专利技术优选的实施方案中，所述感受态宿主菌是原核生物，优选是E.coliBL21 感雙态宿主菌。 在本专利技术优选的实施方案中，上述含有牛抑制素a亚基成熟肤基因表达载 体构建方法的步骤似中包括反转录成CDNA与PCR扩增2个反应。反转录体系为， Oligod灯）40yLDEPC水 420yLRRI20yL5XBufferfOOyLdNTPSOyLM-MLV40yL。 [002引更优选地，上述PCR扩增体系如下，建立25 反应体系：模板2.Oyl,Es Mixl2y1，上下游引物各lul，d地209y1。反应条件为：94°C预变性2min，94°C变性30s， 60°C退火30s，72°C延伸30s，25个循环；最后72°C延伸2min，4°C保持lOmin。扩增产物与 SXLoadingBuffer按5 :1的比例混合，于1%琼脂糖凝胶中进行电泳（电泳条件：电压 150V，电泳时间20min)，电泳结束后在凝胶成像仪上检测目的条带并拍照观察。 在本专利技术优选的实施方案中，上述含有牛抑制素a亚基成熟肤基因表达载体构 建方法的步骤（3)中将扩增得到的RT-PCR产物连接到PMD19-T载体，转化到E.COliD册a 感受态细胞宿主菌进行克隆。更优选地，上述连接反应体系为cDNA加1，T4DNA连接酶0.加1，PMD19T载体 0. 5yl，PMD19TSolutionl5yll6°C连接过夜。阳性菌落PCR鉴定方法为将连接产物转化 D册a感受态细胞，涂布于含有AMP的LB平板培养基，待平板表面干后倒置，于37°C过夜培 养至白色菌落出现。用黄色枪头挑取白色菌落接种于新的LB固体平板上做划线培养，培养 6个小时后做菌落PCR。挑取跑出菌落PCR条带的菌落接种于含Amp(lOOmg/ml)LB液体培 养基中37°C，190rpm过夜培养，至菌体出现浑浊。本专利技术在克隆过程中创新了菌落PCR鉴 定运一方法，应用此方法可显著提高试验效率本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种从牛卵巢中提取的牛抑制素α亚基成熟肽基因，特征在于：其多核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：倪和民，吴迪，郭勇，邢书涵，常迪，盛熙晖，齐晓龙，刘迪，
申请(专利权)人：北京农学院，
类型：发明
国别省市：北京;11
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