本发明专利技术公开了能抑制MAT2A基因表达的siRNA及其应用。本发明专利技术的抑制MAT2A基因表达的siRNA MAT2A-1，其正义链如SEQ ID NO.2所示，反义链如SEQ ID NO.3所示；抑制MAT2A基因表达的siRNA MAT2A-2，其正义链如SEQ ID NO.4所示，反义链如SEQ ID NO.5所示。根据抑制MAT2A基因表达的siRNA构建的抑制MAT2A基因表达的慢病毒表达载体联合过表达MAT1A基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第256位-1443位碱基所示)的慢病毒载体转染肝癌细胞成功的抑制了肝细胞癌血管生成、迁移和侵袭、肺转移，其可进一步应用于制备治疗肝癌疾病的药物，具有很高的理论和应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及能抑制MAT2A基因表达的SiRNA及其应用。
技术介绍
肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC)是最常见的恶性肿瘤之一，位居全 国癌症发病率第二位，每年因肝癌死亡的人数约为35万。目前，手术切除和肝移植是治疗 肝癌最有效的方法。但由于早期诊断率低、肝移植供体紧缺等原因，大部分患者失去了根 治性手术的机会，患者5年生存率仅为10-20%。经动脉灌注化疗栓塞（Transarterial chemoembolization，TACE)是不能手术切除肝癌的主要治疗手段，可促进肿瘤缺血性坏死， 抑制其生长，但栓塞难以彻底，术后的复发与转移始终是提高远期疗效的瓶颈；而传统的手 术、放疗、化疗或中药等方法的治疗效果欠佳。因此，寻求新的治疗模式迫在眉睫，而基因治 疗可能是从根本上解决这一难题的希望。 肝细胞癌的多种基因出现异常表达，其中MAT基因较为特别。MAT基因可分为 MAT1A基因与MAT2A基因，编码唯一能催化合成S-腺苷蛋氨酸的酶一一腺苷蛋氨酸转移酶 (Methionine adenosyltransferase，MAT)。MAT 有三种同工酶，分别是 MATI、MATIII和 MATII，前两种是 MAT1A (Methionine Adenosyltransferase 1A)基因编码的产物，后一种 是 MAT2A(Methionine Adenosyltransferase 2A)基因编码的产物。MAT1A 基因主要在成 人肝脏中表达，而MAT2A基因在除肝脏以外的人体组织器官中广泛表达。有趣的是，胎肝中 主要表达的是MAT2A，在胎儿出生后逐步被MAT1A取代。在肝癌中MAT2A被诱导重新表达， MAT1A的表达则发生沉默，这种转变为肝癌细胞生长提供有利条件。国内外学者针对MAT基 因已经做了多方面的研究，也取得可喜的成果。Cai等发现，恢复MAT1A表达的Huh-7细胞 内SAMe的含量增加了 52%，而DNA合成速率下降了 20%，肿瘤细胞生长速度减缓了 25% ; 再导入MAT2A反义RNA后，这些作用进一步增强。Li等构建过表达MAT1A的Huh-7稳定表 达细胞株，发现SAMe升高将近3倍，细胞凋亡率升高超过2倍，生长受抑制；体内实验显示， 过表达MAT1A的Huh-7在裸鼠成瘤速率下降约50 %，微血管密度下降40 %，SAMe含量升高 2倍。Liu等应用RNA干扰技术抑制MAT2A的表达，结果显示MAT2A基因的mRNA含量和MAT II活性均降低，细胞凋亡指数接近30 %。这些研究表明，针对MAT基因的干预可明显抑制肝 癌细胞的增殖，诱导细胞凋亡，减缓肿瘤的生长。然而，至今对于MAT1A和MAT2A联合干预 肝癌细胞成瘤的研究仍然较少，尤其是MAT基因的表达失调对肝癌血管生成及侵袭转移是 否有影响，目前尚未见报道。 RNA干扰（RNA interference，RNAi)是指一些外源性或内源性小双链RNA (small interfering RNA，siRNA)在细胞内根据碱基配对原则与相应的mRNA结合，诱导mRNA降 解，特异性、高效地阻断特定基因的表达，导致细胞出现相应基因表达缺失的技术。Guo等在 1995年将正义链或反义链RNA导入线虫体内，发现其par-1基因表达被特异性抑制了。随 后，Fire等在1998年证实，真正有效地抑制目的基因表达的是双链RNA，从此揭开RNAi的 神秘面纱。RNAi特异性降解同源mRNA，对基因的转录过程无影响，而是影响基因的翻译过 程，因此也称转录后基因沉默。RNAi效率高、特异性强、操作简单等特点，已经成为研究特定 基因功能的常用技术。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种能抑制MAT2A基因表达的siRNA。 本专利技术的能抑制MAT2A基因表达的siRNA，其特征在于，包括siRNA MAT2A-1或 siRNA MAT2A-2 ；所述的 siRNA MAT2A-1，其正义链为：5' -GCAACA⑶CACCAGAUAUU-3'（如 SEQ ID NO. 2 所示），其反义链为：5' -AAUAUCUGGUGACUGUUGC-3'（如 SEQ ID NO. 3 所示）；所述的 siRNA MAT2A-2,其正义链为：5' -GCCUAUGGCCACUUUGGUA-3'（如 SEQ ID NO. 4 所示），其反义链为：5' -UACCAAAGUGGCCAUAGGC-3'（如 SEQ ID NO. 5 所示）。 本专利技术的第二个目的是提供一种抑制MAT2A基因表达的慢病毒表达载体，其特征 在于，其是将能抑制MAT2A基因表达的siRNA转入慢病毒载体而得到的。 所述的载体为慢病毒载体P⑶H-U6。 本专利技术的第三个目的是提供过表达MAT1A基因的慢病毒载体联合抑制MAT2A基因 表达的慢病毒表达载体在制备抑制肝癌药物中的应用，所述的MAT1A基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1的第256位-1443位碱基所示。 所述的抑制肝癌的药物是抑制肝癌血管生成、肝癌迀移和侵袭、肝癌肺转移的药 物。 过表达MAT1A基因的慢病毒载体优选是将MAT1A基因插入慢病毒载体p⑶H-CMV 的酶切位点EcoR I和BamH I之间而得到的。 通过GenBank搜索，获得人源MAT1A的cDNA序列（Gene ID:4143,其序列如SEQ ID NO. 1所示，具体的MAT1A基因如SEQ ID NO. 1的第256位-1443位碱基所示），设计引 物并经PCR扩增cDNA后，使用EcoR I和BamH I进行酶切，再与经过同样酶切的慢病毒载 体pCDH-CMV连接；然后转化感受态大肠杆菌DH5 a进行扩大培养；进行纯化质粒后可得到 表达MAT1A基因的慢病毒载体p⑶H-MAT1A，测序验证其序列的正确性；通过将慢病毒载体 转染SMMC-7721细胞后验证转染后MAT1A基因的mRNA水平显著升高。 敲低MAT2A的慢病毒载体是采用siRNA表达载体法来实现的。根据在GenBank 中搜索确定人源MAT2A的mRNA序列（Gene ID:4144)，设计并筛选得到了可有效抑制 SMMC-7721 中 MAT2A 的 mRNA 表达的 siRNA MAT2A-1 和 siRNA MAT2A-2,再合成对应的 siDNA 序列，经PCR扩增后，使用Cal I和BamH I进行酶切，再与经同样酶切的慢病毒载体 p⑶H-U6连接；转化感受态大肠杆菌DH5 a进行扩大培养；纯化质粒后可得到敲低MAT2A的 慢病毒载体P⑶H-sh-MAT2A-l和p⑶H-sh-MAT2A-2,测序验证其序列的正确性；通过将慢病 毒载体转染SMMC-7721细胞后验证转染慢病毒载体pCDH-sh-MAT2A-l和pCDH-sh-MAT2A-2 的SMMC-7721细胞中MAT2A的mRNA水平显著降低。将构建好的慢病毒载体 pCDH-MATIA、pCDH-sh-MAT2A-l、pCDH-sh-MAT2A-2 以 及空载体质粒P⑶H-CMV、p⑶H-U6进行慢病毒包装，经过293T细胞扩增，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种能抑制MAT2A基因表达的siRNA，其特征在于，包括siRNA MAT2A‑1或siRNA MAT2A‑2；所述的siRNA MAT2A‑1，其正义链为：5’‑GCAACAGUCACCAGAUAUU‑3’，其反义链为：5’‑AAUAUCUGGUGACUGUUGC‑3’；所述的siRNA MAT2A‑2，其正义链为：5’‑GCCUAUGGCCACUUUGGUA‑3’，其反义链为：5’‑UACCAAAGUGGCCAUAGGC‑3’。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李家平，
申请(专利权)人：李家平，王锐智，姚学华，范文哲，
类型：发明
国别省市：广东;44
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