本发明专利技术涉及转录激活子样效应因子核酸酶及其编码基因与应用，包括3对短肽，3对短肽分别为第一对短肽、第二对短肽和第三对短肽，第一对短肽识别SEQIDNO.1和SEQIDNO.2的DNA序列，第二对短肽识别SEQIDNO.3和SEQIDNO.4的DNA序列，第三对短肽识别SEQIDNO.5和SEQIDNO.6的DNA序列。本发明专利技术利用这3对短肽构建获得的转录激活子样效应因子，能够分别特异识别人miRNAs：miR-133b、miR-141和miR-488基因种子序列附近的二段相邻核苷酸；利用这3对转录激活子样效应因子构建获得的转录激活子样效应因子核酸酶，能够对人miRNAs：miR-133b,miR-141和miR-488基因进行准确、高效地打靶。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，具体为转录激活子样效应因子核酸酶及其编码基因与应用，尤其为应用于人类miRNAs基因的敲除。
技术介绍
基因组靶向修饰是近年来生命科学研究的热点之一，特别是在基因治疗人类疾病方面，基因组靶向修饰具有广阔的应用前景。通过转基因或者基因敲除等操作改变基因的遗传组成，获得满足各种需要的基因工程工具。传统较常用的转基因方法为质粒稳定转染法、反转录病毒携带法和同源重组法。但质粒转染稳定筛选的插入位点随机，且需要抗生素维持，容易导致非正常的细胞表型；而反转录病毒携带目的基因的效率虽高，但是插入位点不确定，影响其它内源基因的表达，限制了该方法的应用；另外，同源重组法虽然可以定点插入，但是成功率很低（重组概率为10-6-10-7）。 目前，基因组工程学中的三大利器为：ZFN（Zinc Finger Nucleases）、TALEN（Transcription Activator-like Effector Nuclease）和CRISPR/Cas9。 ZFN是指锌指蛋白，是转录因子，每个模块识别3-4个碱基序列，将这些模块混合搭配，可以靶定任何序列，然后，通过C末端的Fok I核酸内切酶结构域可以切断双链DNA分子。Sangamo生物科学公司和Sigma- Aldrich公司已经将ZFN技术商业化，推出CompoZr? ZFN平台。但是，由于锌指蛋白之间存在相互作用，锌指模块与DNA序列之间没有一个简单的对应关系，所以以锌指蛋白为基础设计针对序列特异性DNA结合蛋白依然是个难题，并且花费昂贵，经常要做大规模的筛选，构建过程长达几周至数月。 CRISPR/Cas9系统是由短的向导RNA介导，Cas9核酸酶在特定的双链DNA位点上产生断裂。CRISPR/Cas可通过添加多个向导RNA而实现多重编辑。然而，由于向导RNA序列比ZFN或TALEN所靶定的序列短，致使脱靶效应高。但Church最近发现，通过利用Cas9的一种突变形式（只切割单链DNA）和两个紧挨着的向导RNA，有可能大大提高系统的切割位点保真性，降低脱靶效应。 TALEN技术是一种崭新的分子生物学工具。TALEN是转录激活样效应因子，来源于黄单胞杆菌。利用TALEN蛋白的核酸结合结构域的氨基酸序列与核酸序列有恒定的对应关系，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白，再通过添加非特异内切酶Fok I结构域，TALEN蛋白在理论上可以靶向切割任意基因组DNA双链。TALEN蛋白中DNA结合域为高度保守的重复单元，每个重复单元含有34个氨基酸，除了第12和13位氨基酸变化外，其它氨基酸都是相同的，这两个可变氨基酸被称为重复序列可变的双氨基酸残基（repeatvariable di-residues，RVD），与碱基识别相关。TALEN识别DNA的机制在于每个重复序列的RVD可以特异识别DNA的1个碱基，HD特异识别C碱基，NI识别A碱基，NN识别G碱基，NG识别T碱基。另外，通过对天然TALEN的研究发现，TALEN蛋白框架固定识别1个T碱基，所以TALEN的识别序列总是以T碱基开始。 在真核细胞内，TALEN切割的双链DNA，可以激活两条保守的DNA修复通路。非同源末端连接修复（non-homologous end joining，NHEJ），细胞基本上磨平断裂DNA的两端，再将其彼此拉近，将断裂的染色体重新连接，这个过程往往产生移码，或者在断裂位点引进小片段插入或删除，影响基因功能或产生基因敲除效应。同源指导修复（homology-directed repair，HDR）是指利用相似序列的DNA供体模板，代替断裂点周围的DNA序列，从而实现特定突变或导入外源DNA序列的目的。在本专利技术专利中，采用携带同源模板的pMD18载体共同转染细胞系的方法，使细胞基因组在TALEN切断双链DNA分子时，利用pMD18载体提供的同源序列，高效精确地对基因组进行编辑。 TALEN技术可以广泛的应用于基因组编辑的各个方面：细胞水平的基因敲除，定点突变，结构域缺失，定点整合等等，在疾病治疗领域具有广泛的应用前景。目前TALEN 技术主要的缺陷是效率相对较低，一般在5%-20%，无法直接获取100%编辑的细胞，只能通过挑选阳性的单克隆细胞，扩增成为稳定株。 miRNAs是一类进化上高度保守的非编码单链RNA，长度通常在22nt左右。自1993年，Lee，Feinbaum和Ambros等在线虫体内发现了第一个miRNA（lin-4）以来，miRNAs的数据与日俱增，miRNAs相关预测软件也日益成熟。miRNAs由基因组DNA编码，在RNA聚合酶Ⅱ的作用下转录成为pri-microRNAs，通过Drosha和Dicer等一系列酶切之后形成成熟的miRNAs，最终与多种蛋白共同形成miRNAs诱导的沉默复合体（miRNA-induced silencing complex，miRICS）主要结合于靶mRNA的3'-UTR区域，阻遏翻译甚至直接降解mRNA，抑制基因表达。目前，已经有超过2500余种人类miRNAs被发现。miRNAs参与多种生物学功能，如调节细胞发育、分化、增殖、凋亡等。一些miRNAs在癌症发生发展中发挥作用，其中一些miRNAs抑制肿瘤发生，称为tumor suppressor miRNAs（TSmiRs）；另一些miRNAs促进肿瘤发生，则称为oncogenic miRNAs，即oncomiRs。目前，针对miRNAs的基因操作主要分为两种：1.化学合成的反义寡核苷酸，其序列与成熟miRNAs序列互补，通过抑制miRNAs而发挥作用；2.与天然miRNAs序列相同的小分子，可增强miRNAs的作用，此方法的作用机制类似于RNA干扰，不同的是，天然miRNAs因为其序列来源于细胞基因组，体内存在miRNAs表达调控机制，故较RNAi脱靶效应小，免疫反应轻。但是，由于此两种miRNAs的基因操作均不能在基因组水平改造miRNAs，故其起效时间持续短、疗效不稳定、效果不确定。2014年，美国加利福尼亚州立大学的Claudia研究组针对人类miR-21基因在细胞系HEK-293中成功实现了双敲除。现阶段，涉及人类miRNAs基因敲除的问题主要有：1. miRNAs编码序列仅300核苷酸左右，比较难找到高效的TALEN打靶序列；2. miRNAs的拷贝数可能不止一个，同家族成员也为多个，故有效的双敲除和多敲除是关键问题；3. miRNAs多协同发挥作用，敲除单个miRNAs基因的治疗作用有待考察。本专利技术对人类miRNAs：miR-133b, miR-141和miR-488基因进行敲除，采用新兴的TALEN技术，针对位点为miR-133b, miR-141和miR-488的种子序列，以达到有效去除miRNAs的作用。
技术实现思路
针对现有技术的上述技术问题,本专利技术的目的是提供一种转录激活子样效应因子核酸酶及其编码基因与应用。本专利技术提供了3对短肽，利用这3对短肽构建获得的转录激活子样效应因子，能够分别特异识别人miRNAs：miR-133本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种转录激活子样效应因子核酸酶，其特征在于：包括3对短肽，所述的3对短肽分别为第一对短肽、第二对短肽和第三对短肽，所述第一对短肽识别SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2的DNA序列，所述第二对短肽识别SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4的DNA序列，所述第三对短肽识别SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6的DNA序列。
【技术特征摘要】
1.一种转录激活子样效应因子核酸酶，其特征在于：包括3对短肽，所述的3对短肽分别为第一对短肽、第二对短肽和第三对短肽，所述第一对短肽识别SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2的DNA序列，所述第二对短肽识别SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4的DNA序列，所述第三对短肽识别SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6的DNA序列。
2.如权利要求1所述的转录激活子样效应因子核酸酶，其特征在于：所述的短肽由分别识别人类miR-133b、miR-141和miR-488基因上核苷酸序列中相应碱基的TALENs识别模块依序连接而成；识别碱基A的TALENs识别模块为NI，识别碱基T的TALENs识别模块为NG，识别碱基C的TALENs识别模块为HD，识别碱基G的TALENs识别模块为NK。
3.如权利要求1所述的转录激活子样效应因子核酸酶，其特征在于：包括第一对蛋白质、第二对蛋白质和第三对蛋白质，所述第一对蛋白质由第一对短肽两端分别加上转录激活子样效应因子氨基酸序列框架的N端和C端组成，所述第二对蛋白质由第二对短肽两端分别加上转录激活子样效应因子氨基酸序列框架的N端和C端组成，所述第三对蛋白质由第三对短肽两端分别加上转录激活子样效应因子氨基酸序列框架的N端和C端组成；所述的转录激活子样效应因子氨基酸序列框架的N端和C端均为天然的或经过人工改造的序列。
4.如权利要求3所述的转录激活子样效应因子核酸酶，其特征在于：包括第一对融合蛋白、第二对融合蛋白和第三对融合蛋白，所述第一对融合蛋白由第一对蛋白质与...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋春娇，茹国美，张伟光，杨万雷，
申请(专利权)人：绍兴市人民医院，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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