一种基于多重循环延伸连接的靶基因区域富集新方法技术

本发明专利技术提供了一种基于多重循环延伸连接的靶基因区域富集新方法，实验结果表明，该方法可以实现多重目的基因的基因片段富集，目的基因片段数可以是数十至数万。多重目的基因片段的富集产物可以通过修饰及纯化定量后用于各种二代测序平台的测序分析。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体地说，本专利技术涉一种基于多重循环延伸连接的靶基因区域富集方法。
技术介绍
虽然用1000美元测定人类基因组的目标快要实现，但基因组研究的总成本应包括DNA测序、数据管理和数据分析(产生可直接解读的数据)的成本，这使得在大的群体水平研究以及临床应用中，基因组研究的实际成本在短时间内很难降低。近期，一种新的研究方法可以对疾病的特定区域和生物学通路、基因，甚至对整个外显子组(占基因组的1％)进行富集，然后进行无偏的研究，这种方法就是目标区域富集高通量测序。目标区域富集高通量测序是针对感兴趣的一段或几段序列进行探针设计，通过不同的方法进行捕获富集，并进一步对捕获到的序列进行测序分析。由于其探针设计灵活、覆盖深度高的特点，更适用于大样本量疾病样本分析，或对全基因组、GWAS分析或连锁分析等结果进行验证；不仅能验证已发现的位点，同时能够进一步找到候选区域中的疾病易感位点。对目标基因进行富集后再进行高通量测序(NGS)的方法有如下优势：1)可显本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核酸片段的富集方法，其特征在于，所述方法包括步骤：(1)提供一反应体系所述反应体系中至少包括：待测样本、n个探针组、核酸聚合酶和核酸连接酶；所述n≥2，各个探针组中分别包含第一探针和第二探针；所述第一探针和所述第二探针分别与同一条目标核酸片段的3’端和5’端特异性杂交(所述特异性杂交是指至少部分互补或完全互补)；所述第一探针不能被5'端方向核酸外切酶降解；所述第二探针不能被3'端方向核酸外切酶降解；所述第一探针包括与目标核酸片段3'端特异性杂交的第一部分和与后续PCR扩增引物序列相对应的第二部分(所述相对应是指所述第二部分的反向互补序列与PCR扩增引物能够特异性杂交)；所述第二探针包括与目...

【技术特征摘要】
1.一种核酸片段的富集方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(1)提供一反应体系
所述反应体系中至少包括：待测样本、n个探针组、核酸聚合酶和核酸连
接酶；
所述n≥2，各个探针组中分别包含第一探针和第二探针；
所述第一探针和所述第二探针分别与同一条目标核酸片段的3’端和5’端特
异性杂交(所述特异性杂交是指至少部分互补或完全互补)；
所述第一探针不能被5'端方向核酸外切酶降解；
所述第二探针不能被3'端方向核酸外切酶降解；
所述第一探针包括与目标核酸片段3'端特异性杂交的第一部分和与后续PCR
扩增引物序列相对应的第二部分(所述相对应是指所述第二部分的反向互补序列与
PCR扩增引物能够特异性杂交)；
所述第二探针包括与目标核酸片段5’端特异性杂交的第一部分和与后续PCR
扩增引物序列特异性杂交的第二部分；
当所述所述第一探针和所述第二探针与同一目标核酸片段特异性杂交时，所
述第一探针的3'末端与所述第二探针的5'末端至少间隔1个核苷酸的距离；
(2)杂交和延伸连接
所述第一探针和所述第二探针在高温变性、退火过程中与所述待测样本的目
标核酸片段特异性杂交，在所述核酸聚合酶作用下，所述第一探针沿所述目标核酸
片段进行DNA链延伸，延伸至所述第二探针的5'末端时被其阻滞，获得第一探针
延伸DNA链；以及在所述核酸连接酶的作用下，将所述第一探针延伸DNA链3'端
与所述第二探针5'端连接，从而形成含连接产物的反应混合物；和
任选地重复上述“变性-退火-延伸-连接”，从而增加所述反应混合物中
所述连接产物的数量；
(3)消化
对步骤(2)的所述反应混合物，用核酸外切酶进行消化处理，从而获得经消化
的反应混合物，所述反应混合物中含有未被消化的所述连接产物；
(4)富集
以步骤(3)的所述未被消化的所述连接产物为模板，进行PCR扩增，从而获得

\tPCR扩增产物，即为富集的核酸片段。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一探针不能被5'端方向核酸
外切酶降解,能够被3'端方向核酸外切酶降解；和/或
所述第二探针不能被3'端方向核酸外切酶降解，能够被5'端方向核酸外切酶
降解。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸聚合酶为高温耐热核酸
聚合酶，优选地，所述核酸聚合酶选自下组：Hemo(NEB)、AMPLITAQ
DNAPOLYMERASE(A...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜正文，杨锋，
申请(专利权)人：天昊生物医药科技苏州有限公司，上海天昊生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32