本发明专利技术涉及一种大豆MYB转录因子基因提高大豆异黄酮生物合成的应用，属于基因工程技术领域。GmMYB9基因大小为1188bp，编码395个氨基酸；酵母单杂交实验结果表明GmMYB9具有转录激活活性，亚细胞定位结果证明GmMYB9定位在细胞核中；实时荧光定量PCR结果表明GmMYB9在大豆未成熟胚向成熟种子发育过程中的表达趋势与异黄酮的积累趋势一致，在高异黄酮品种中的表达量高于异黄酮含量低的品种；转化GmMYB9基因的T2代转基因大豆种子和叶片中的异黄酮含量均有提高，证明GmMYB9基因参与调控大豆异黄酮的生物合成，对培育高异黄酮大豆品种具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，涉及大豆MYB转录因子GmMYB9基因提高大豆异黄酮生物合成的应用。
技术介绍
大豆含有丰富的蛋白质和油脂，是重要的粮食和经济作物。大豆中的异黄酮能够提高植物防御非生物胁迫的能力，同时在人类的营养和健康方面具有诸多功效。异黄酮合成途径是植物苯丙烷类代谢途径的分支途径，苯丙烷类代谢在植物中普遍存在，但异黄酮主要在豆科植物中合成，它的积累受遗传因素和环境因素共同决定。异黄酮代谢途径由多个关键酶共同催化完成，单独调节某一个关键酶无法获得预期的结果。但是MYB转录因子基因通过与异黄酮合成途径关键酶基因的启动子结合，能够调控多个关键酶基因的表达和mRNA转录的起始，进而参与调控异黄酮的生物合成。因此，研究大豆的MYB转录因子，分析其在转录水平上对异黄酮生物合成的调控，阐明其相关功能，有助于进一步了解大豆异黄酮的调控机理。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种大豆MYB转录因子GmMYB9基因提高大豆异黄酮生物合成的应用。大豆异黄酮含量属于数量性状，是定量遗传类型。近年来，已有研究报道显示位于数量性状位点(Quantitative Trait Locus,QTL)附近的基因能够调控相应的数量性状，如玉米籽粒行数QTL附近的FASCIATED EAR2通过调控每穗玉米的籽粒行数来提高玉米产量，所以我们将目标聚焦在位于大豆异黄酮QTL附近的MYB类转录因子。为了降低遗传因素及环境因素对大豆异黄酮含量的影响，我们比较分析前人的研究结果，选取不同品种的自交系在不同年份、不同地点定位到的位于大豆第6号染色体上游、与大豆异黄酮合成相关的2个QTL，GLY1和qGm06，在qGm06的closet marker下游0.3cM处找到候选MYB转录因子基因GmMYB9，到目前为止，关于GmMYB9的作用还未见报道。本专利技术利用gateway技术构建GmMYB9的植物表达载体，通过农杆菌介导的大豆胚尖遗传转化方法将GmMYB9转入大豆中，获得T2代转基因大豆，用高效液相法(HPLC)测量T2代转基因大豆的叶片及种子中的异黄酮含量，与野生型相比，转基因植株种子异黄酮含量提高了1.11倍，叶片异黄酮含量提高了1.56倍，叶片中的异黄酮含量提升幅度更高，说明GmMYB9基因主要在叶片中调控异黄酮的生物合成。在前人的研究中，R1-MYB转录因子GmMYB176能够在发根中调控大豆异黄酮的生物合成；玉米的CRC基因(玉米R2R3-MYB类转录因子与bHLH类转录因子的基因融合序列)在大豆种子中超表达，总异黄酮的含量提高了3倍多，若表达CRC的同时抑制与IFS竞争底物的酶基因F3H(flavanone 3-hydroxylase)的表达，异黄酮的含量能提高4倍多。虽然GmMYB9基因在大豆种子中调控异黄酮的生物合成效果没有玉米的CRC基因明显，但GmMYB9基因能够提高大豆叶片中的异黄酮含量，这在现有的研究中尚未见到相关报道。由于异黄酮能够提高植物防御非生物胁迫的能力，所以推测在大豆的复叶期至完熟期的过程中如果遇到非生物胁迫，GmMYB9在大豆叶片中调控异黄酮的生物合成就会发挥抵御非生物胁迫的功效。本专利技术所提供的大豆MYB转录因子GmMYB9，编码基因如SEQ ID No.1所示，它是由395个氨基酸残基组成的蛋白质，序列如SEQ ID No.2所示，属于典型的R2R3型大豆MYB转录因子。本专利技术所提供的大豆MYB转录因子GmMYB9基因在提高大豆异黄酮生物合成中的应用。本专利技术所提供的大豆MYB转录因子GmMYB9基因在提高大豆叶片中异黄酮生物合成中的应用。利用任何一种能够引导外源基因在植物中表达的载体，将本专利技术所提供的GmMYB9编码基因导入植物细胞，可获得异黄酮含量提高的转基因细胞系及转基因植株。使用本专利技术的基因构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素、卡那霉素等)。携带有本专利技术GmMYB9的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物。本专利技术的基因对改良豆科植物异黄酮代谢，特别是培育高异黄酮大豆品种具有重要意义。附图说明图1是GmMYB9的PCR扩增结果图，M.DNA Marker(DL2000)，1.PCR结果；图2是GmMYB9在酵母系统中的激活能力分析图；图3是亚细胞定位载体转化农杆菌菌液PCR图，M.DNA Marker(DL2000)，1-2PCR结果；图4是GmMYB9的亚细胞定位结果图；图5是GmMYB9在大豆不同组织中的表达图；图6是连接CHS8启动子序列的pCAMBIA1301载体转化农杆菌电泳图，M.DNA Marker(DL2000)，1-2PCR结果；图7是烟草叶片GUS活性分析图，A:CK；B:CaMV 35S；C:CHS8promoter；D:CHS8promoter+GmMYB9；图8是植物表达载体转化农杆菌菌液PCR电泳图，M.DNA Marker(DL2000)，1-4PCR结果；图9是部分T0、T1、T2代转基因植株的PCR检测结果图，M：DNA Marker(DL2000)；P：阳性质粒；N：野生型大豆；1-14：转基因大豆；图10是部分T2代转基因植株的Southern blot检测结果图，P：阳性质粒；WT：野生型大豆；1-3：转化pCB35SR1R2-GFP-GmMYB9载体的植株；图11a是野生型与T2代转基因植株的种子异黄酮含量图，WT：野生型大豆；1-3：转化pCB35SR1R2-GFP-GmMYB9载体的植株；图11b是野生型与转化基因GmMYB9的T2代转基因植株的新鲜叶片异黄酮含量图，WT：野生型大豆；1-3：转化pCB35SR1R2-GFP-GmMYB9载体的植株；图12是GmMYB9在转基因植株中的表达量图，WT：野生型大豆；1-3：转化pCB35SR1R2-GFP-GmMYB9载体的植株；图13是转GmMYB9基因T2代叶片中异黄酮合成关键酶基因的表达量分析图；WT：野生型大豆；1-3：转化pCB35SR1R2-GFP-GmMYB9载体的植株。具体实施方式实施例1、大豆GmMYB9基因的克隆用RNAiso Plus(购自TaKaRa)提取大豆品种Williams 82的20d胚总RNA，经1％琼脂糖电泳检测RNA的完整性。cDNA的合成按照Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)的说明书进行。根据GmMYB9的全长序列设计引物，引物为：GmMYB9-F：AACAACATAGAGAGCCATAATACCCGmMYB9-R：CATAGACTCCTCTTTCAAACACCTC按照表1反应体系进行PCR扩增：表1PCR扩增反应体系PCR反应程序为：95℃4min；94℃30s，57℃50s，72℃90s，30个循环；72℃延伸10min。经PCR扩增得到GmM本文档来自技高网...
【技术保护点】
大豆MYB转录因子GmMYB9基因在提高大豆异黄酮生物合成中的应用。
【技术特征摘要】
1.大豆MYB转录因子GmMYB9基因在提高大豆异黄酮生物合成中的应用。2.大豆MYB转录因子GmMYB9基因在提高大豆叶片中异黄酮生物合成中的应用。3.如权利要求1所述大豆MYB转录因子GmMYB9基因在提高大豆异黄酮生物合成中的应用，所述大豆MYB转录因子GmMYB9的序列如SEQ ID No.2所示。4.如权利要求1所述大豆MYB转录因子GmMYB9基因在提高大豆异黄酮生物合成中的应用，所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：王庆钰，赵明珠，闫帆，王英，李景文，王天亮，郭文云，申梓邑，何禹璇，程浩，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22
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