基于共区域化识别激活的级联信号放大策略检测转录因子的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于共区域化识别激活的级联信号放大策略检测转录因子的识别探针、试剂及检测方法。本发明专利技术通过构建一种转录因子的新型识别方式‑共区域化识别，进而激活后续级联链置换扩增，实现了对NF‑κB p50的高灵敏检测，检测灵敏度为0.2pM。本发明专利技术的检测方法还实现了实际样品中NF‑κB p50的检测。检测过程中过量的分裂识别组件无法自行杂交成双链结构，无法触发后续的级联信号放大过程，消除了过量识别探针去除不完全引起的假阳性影响。

Method for detecting transcription factor based on activation of cascade signal amplification strategy identified by CO regionalization

The invention discloses a recognition probe, a reagent and a detection method based on the detection of a transcription factor by a cascade signal amplification strategy based on the activation of a common regionalization. Through the construction of a new way of identification of transcription factor colocalization recognition, and subsequent activation cascade of strand displacement amplification, the realization of NF P50 kappa B high sensitive detection, the detection sensitivity is 0.2pM. The detection method of the invention realizes the actual samples in NF kappa B p50. In the process of detection, the excessive splitting recognition component can not self cross the double chain structure, and can not trigger the subsequent cascade signal amplification process.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种基于共区域化识别激活的级联信号放大策略检测转录因子的方法。
技术介绍
转录因子(TFs)是一类序列特异性DNA结合蛋白，在基因调控过程中发挥关键作用。它们通过识别位于基因调控区域中的一小段双链DNA序列进行基因信息的调控(DNA到RNA的表达)。TFs的正常调控对于细胞发育，细胞分化和修复等生命过程至关重要，而TFs的异常调控将会导致一系列疾病，例如，发育障碍，异常激素反应，炎症和癌症等。核因子κB(NF-κB)是一类广泛存在于各种细胞的转录因子，通常以二聚体形式存在于细胞质中，受到外界刺激时通过结合基因组中的κB位点对炎症和免疫等重要生物过程进行调控。但NF-κB的异常调控将会导致癌症、炎症等疾病。转录因子的表达水平能够敏感地反映出细胞发展过程和疾病状态，目前已经成为医学诊断和药物开发的重要标志物。因此，灵敏检测转录因子的表达水平对于理解深入基因调控机制，疾病诊断和药物开发都具有十分重要的意义。疾病处于早期阶段时，TFs通过呈现较低的表达水平，因此，通过适当的信号扩增技术对TFs进行高灵敏检测对于疾病的早期诊断至关重要。外切酶切割辅助的荧光扩增检测法，灵敏度高，但需要利用一种或两种外切酶切割过量识别探针，切割不完全将会导致识别探针进入后续信号输出过程，引起假阳性信号。因此，亟需发展一种无需外切酶参与的高灵敏荧光检测方法。
技术实现思路
针对上述现有技术中存在的不足，本专利技术的目的是提供一种基于共区域化识别激活的级联信号放大策略检测转录因子的方法。通过构建共区域化识别这一新型识别方式，进而激活后续级联链置换扩增，实现目标物的高灵敏检测，对于临床诊断和疾病治疗方面具有较大的应用潜力。为实现上述目的，本专利技术采用下述技术方案：本专利技术的第一方面，提供一种用于检测转录因子的识别探针，包括：单链DNA S1、S2和S3；所述单链DNA S1包括：TF的分裂识别序列I、链置换辅助序列和内切酶识别位点；所述单链DNA S2包括：TF的分裂识别序列II和与链置换辅助序列互补的序列；所述单链DNA S3为目标物TF的识别双链中的一条链(“识别双链”是指TF的识别双链DNA，包括DNA S3以及DNA S1中的识别序列I和DNA S2中的识别序列II，DNA S3与DNA S1中的识别序列I，DNA S2中的识别序列II互补)。所述单链DNA S1中，切刻酶识别位点的序列为：5′-GCTGAGG-3′。所述单链DNA S1中，链置换辅助序列为：TTTT。所述单链DNA S1中，与链置换辅助序列互补的序列为：AAAA。在本专利技术的一个具体实施方式中，提供了一种用于检测转录因子NF-κB p50的识别探针；所述识别探针包括单链DNA S1、S2和S3；其中，所述单链DNA S1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；具体如下：S1：5’-GGG AGT TGA GTTTTT-3’(SEQ ID NO.1)；(序列中，GGG AGT TGA GTG CTG A为SDA产物的互补序列，即滚环扩增引物的互补序列；阴影部分为内切酶Nt.BbvCI的识别位点；下划线区域为链置换辅助部分；粗体区域为目标物TF的识别序列)。所述单链DNA S2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；具体如下：S2：5’-AAAA-3’(SEQ ID NO.2)；(序列中，粗体区域为目标物TF的识别序列，下划线区域为与S1中链置换辅助序列互补的序列)所述单链DNA S3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；具体如下：S3：5’--3’(SEQ ID NO.3)。本专利技术的第二方面，提供一种检测转录因子的试剂，包含：上述识别探针，以及滚环扩增引物和滚环模板；所述滚环扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体如下：5’-TCAGCACTCAACTCCC-3’(SEQ ID NO.4)；所述滚环模板包括：滚环扩增引物的互补序列，切刻酶识别位点和G四倍体的互补序列。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述滚环模板的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，具体如下：5’-CCCTAACCCTAACCCTAACCCTCCCTAACCCTAACCCT AACCCT-3’(SEQ ID NO.5)。(序列中，阴影部分为内切酶Nt.BbvCI的识别位点，斜粗体部分为滚环扩增引物互补序列；正常字体部分CCCTAACCCTAACCCTAACCCT为G四倍体的互补序列)。进一步的，所述试剂中还包含：KF聚合酶、Nt.BbvCI内切酶、T4DNA连接酶和Phi29DNA聚合酶。本专利技术的第三方面，提供一种检测转录因子的方法，步骤如下：(1)向待检测样品中加入单链DNA S1、S2和S3，进行共区域化识别反应；(2)向步骤(1)的反应体系中依次加入dNTPs、KF聚合酶和Nt.BbvCI内切酶，进行链置换反应；(3)向步骤(2)的反应体系中加入滚环模板和T4DNA连接酶，恒温反应，然后再加入dNTPs、Phi29DNA聚合酶和Nt.BbvCI内切酶，进行指数滚环扩增反应；(4)向步骤(3)反应后的溶液中加入KCl，ThT，孵育，检测荧光强度，构建净荧光强度与转录因子浓度之间的线性方程，对样品中的转录因子含量进行定量检测。步骤(1)中，所述共区域化识别反应是在Cutsmart缓冲体系中进行的；所述Cutsmart缓冲体系的组成为：20mM Tris-HAC，50mM KAC，10mM MgAC2，100ug/mL BSA，pH 7.9。步骤(1)中，所述共区域化识别反应的条件为：37℃恒温箱中，反应3-5h，优选为4h。步骤(2)中，所述链置换反应的条件为：37℃下反应0.5-1.0h，然后于85℃失活0.5h，结束反应。步骤(3)中，指数滚环扩增反应的条件为：37℃下反应2-4h，然后于75℃失活0.5h，结束反应。步骤(4)中，荧光强度检测的光谱条件为：激发波长425nm(狭缝宽度为5nm)，发射波长498nm(狭缝宽度为5nm)，电压700V，收集的荧光光谱范围为450nm-650nm。在本专利技术的一个具体实施方式中，步骤(4)，构建的净荧光强度与转录因子(NF-κB p50)浓度之间的线性方程为：△F＝2880+230log10C(C：M,R2＝0.994)。上述线性方程的线性范围为3.8×10-13M-1.5×10-8M。本专利技术的基于共区域化识别激活的级联信号放大策略检测转录因子的原理为：将转录因子的识别探针分为三部分，构建一种新型识别方式-共区域化识别，进而激活后续级联链置换扩增，实现目标物的高灵敏检测，如图1所示。目标物TF的三部分分裂识别组分均为较短的单链DNA(S1，S2，S3)。S1中包括：TF的分裂识别序列、链置换辅助部分和内切酶(Nt.BbvCI)的识别位点(5′-GCTGAGG-3′)；S2中包括：TF的分裂识别序列，以及与S1中链置换辅助部分互补的序列，与S1中链置换辅助部分互补的序列用来与S1杂交进而引发链延伸；S3为目标物TF的识别双链中的一条链。在操作温度37℃时S1，S2，S3无法自行杂交为双链，因此无法触发链置换放大(SDA)，进而无法产生引发第二步指数滚环扩增(ERCA)的引物(黑色短的单链DNA)，所以，级联扩增无本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测转录因子的识别探针，包括：单链DNA S1、S2和S3；所述单链DNA S1包括：TF的分裂识别序列I、链置换辅助序列和内切酶识别位点；所述单链DNA S2包括：TF的分裂识别序列II和与链置换辅助序列互补的序列；所述单链DNA S3为目标物TF的识别双链中的一条链。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测转录因子的识别探针，包括：单链DNA S1、S2和S3；所述单链DNA S1包括：TF的分裂识别序列I、链置换辅助序列和内切酶识别位点；所述单链DNA S2包括：TF的分裂识别序列II和与链置换辅助序列互补的序列；所述单链DNA S3为目标物TF的识别双链中的一条链。2.如权利要求1所述的识别探针，其特征在于，所述单链DNA S1中，切刻酶识别位点的序列为：5′-GCTGAGG-3′；链置换辅助序列为：TTTT。3.一种用于检测转录因子NF-κB p50的识别探针，其特征在于，包括单链DNA S1、S2和S3；其中，所述单链DNA S1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示所述单链DNA S2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述单链DNA S3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。4.一种检测转录因子的试剂，其特征在于，包含：权利要求1-3任一项所述的识别探针，以及滚环扩增引物和滚环模板；所述滚环扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述滚环模板包括：滚环扩增引物的互补序列，切刻酶识别位点和G四倍体的互补序列。5.如权利要求4所述的检测转录因子的试剂，其特征在于，所述试剂中还包含：KF聚合酶、Nt.BbvCI内切酶、T4DNA连接酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜玮，王磊，朱德颂，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37