赋予病毒抗性的修饰的基因制造技术

本发明专利技术涉及修饰的RDR1基因，其能够赋予植物以病毒抗性及/或增加植物中的病毒抗性，所述修饰导致RDR1基因的增强表达，且其中所述修饰选自与非修饰的野生型RDR1基因相比增加RDR1基因的mRNA水平的修饰；增加RDR1蛋白质水平的修饰；和/或增加RDR1蛋白质活性的修饰。所述修饰可包含RDR1基因编码序列的上游的修饰，如调控元件的修饰，优选地为顺式调控元件的修饰。所述修饰的调控元件选自例如结合转录抑制子的转录因子结合位点，对其修饰导致转录抑制的减少或缺失；和/或转录激活子的转录因子结合位点，对其修饰导致转录的诱导或增强；及/或微小RNA结合位点，对其修饰导致基因抑制的减少或缺失；及/或小RNA序列，对其修饰导致基因抑制的减少或缺失。

Genetically modified virus resistance

The present invention relates to modified RDR1 gene, which can give to plant virus resistance and / or increase in plant virus resistance, the modification leads to the enhanced expression of RDR1 gene, and the wild type RDR1 gene from the modified and non modified compared to modified increase RDR1 gene mRNA levels increased RDR1 protein level; the increase; and / or modified RDR1 protein activity. The modification may include modifications to the upstream of the RDR1 gene coding sequence, such as the modification of the regulatory element, preferably as cis regulatory elements. Regulatory elements selected from the group consisting of a modified such as transcription factor binding transcriptional repressor binding sites of transcription inhibition modification leads to reduced or absent; transcription factors and / or transcription activator binding sites, the modification leads to induce or enhance transcription; and / or small RNA binding sites, the modification leads to gene inhibition of reduced or absent; and / or small RNA sequence, the gene modification leads to inhibition of reduced or absent.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及修饰的RDR基因，其能够对植物赋予病毒抗性和/或增加病毒抗性。本专利技术进一步涉及使用所述修饰的RDR基因用于对植物赋予病毒抗性和/或增加病毒抗性的用途。病毒是攻击植物的主要病原体群体之一，导致影响相关作物方面的负面效应，如影响植物生长、植物活力、产品质量、和产量潜能。和大多数真核生物一样，植物已经针对包括病毒在内的入侵病原体建立了主动防御机制。除了结构和物理障碍如细胞壁外，目前公认的大致还有三种类型的植物免疫系统可保护植物免受病原体侵害。第一种类型对来自许多微生物种类的分子产生应答，其使用跨膜模式识别受体(PPR)，可以与微生物相关分子模式(MAMP)和病原体相关分子模式(PAMP)发生反应。第二种类型的植物免疫系统采用抗性(R)基因编码的多态NB-LRR(核苷酸结合的富亮氨酸重复)蛋白质产物。NB-LRR蛋白质能够探测到来自不同来源的病原体效应子蛋白或其活性。在病原体方面，由Avr基因编码的特异的无毒(Avr)蛋白质或效应子触发宿主植物的R蛋白介导的免疫应答。R基因和Avr的作用/反应引起过敏反应(HR)，这是植物对多类型致病微生物的最常见的反应之一。然而，尽管已有几个克隆的R基因和它们相应的Avr蛋白，却仍不能完全清楚病原体Avr蛋白质如何被其宿主所识别。植物用来保护自身免受病毒或其他病原体侵害的第三种重要的防御机制基于RNA沉默或RNA干扰。RNA沉默是指一类基因沉默效应，其中一个或多个基因的表达被小RNA所下调或完全抑制。大量基因家族及其相关蛋白质家族已被确定为RNA沉默系统的组分。在其中，包括Dicer酶(DCR)基因、Dicer酶样(DCL)基因、Argonaute(AGO)核酸酶基因，以及RNA依赖性RNA聚合酶(RDR)基因。这些基因家族分别包含数个成员，其能以不同组合形式在不同的物种中起作用，并有针对特定病原体或病原体群体的具体功能性和相互作用类型。在宿主植物受到病毒性感染时，RNA病毒建立病毒复制，导致病毒来源的dsRNA的存在。该dsRNA通过作为特定的DCL蛋白质(一种内切核糖核酸酶)的底物发挥功能，触发植物的RNA沉默系统，将所述dsRNA裂解成典型长度为约20-25个碱基对的短片段。在经过进一步加工后，这些短的病毒来源siRNA片段的单链形式被加载到AGO蛋白上，作为宿主植物的RNA诱导的沉默复合物(RISC)的一部分。在RISC中，所述siRNA被AGO蛋白用作指导模板，最终通过一系列的识别和裂解过程导致病毒RNA的降解。RDR基因被认为在此免疫系统中通过以从头合成方式增强生产DCL蛋白质的病毒特异性底物dsRNA而起作用。所得的siRNA积累随后很可能增加对该病毒RNA的识别的效率，从而使其更积极地被沉默或降解作为对策，许多病毒已经演化出通过激活RNA沉默抑制子(RSS)而规避或抑制RNA沉默途径的系统。具体RSS的存在有助于抑制植物的防御，这进而又重新使病毒基因组在目标宿主植物中能够复制和传播，从而有利于进一步感染。特定植物和具体病毒间的沉默和抑制途径的平衡在决定病毒是否会成功建立感染上或在该植物是否将足够强壮能完全或充分抵抗承受攻击上起着很大的作用。虽然已经鉴定出多种所提及的基因都参与植物免疫系统，但很多调节机制、所述这些基因之间的关系、其中不同蛋白质的作用方式仍然难以捉摸。此外，尚未解出个体基因在克服病原体抗沉默的同时对病毒沉默的贡献情况。另外，期望解读相关基因的结构及其表达调节方式的研究仍在进行中。因此，目前还不清楚参与所述RNA沉默途径的何种基因在靶向诱导针对病原体尤其是针对病毒的抗性中是优选的候选，也不清楚应该以何种方式进行修饰以获得所需的效果。本专利技术的一个目标是提供一种对植物赋予病毒抗性的方法。在形成本专利技术的研究过程中，检测到RDR基因中的修饰。该修饰导致相比于野生型RDR基因，RDR基因的增强表达。所述增强的表达可被检测为RDR基因的mRNA积累水平的增加；RDR蛋白质水平的增加；和/或RDR蛋白质的活性增加。编码RNA依赖的RNA聚合酶的RDR基因家族包括数个成员。在植物中，RDR基因通常被分为四个基因簇，表示为基因簇I-IV。在许多植物中，基因组中都存在有RDR基因的组合。拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组编码6个RDR基因，AtRDR1至AtRDR6，而例如水稻(Oryza sativa)基因组包含5个RDR基因，包括OsRDR1至OsRDR4，以及与RDR6成簇的OsSHL2。特定物种也可包括相同基因簇的多个RDR基因拷贝，例如大豆(Glycine max)，它有两个RDR1基因和两个RDR2基因，或高粱(Sorghum bicolor)，它在基因组中具有4个RDR6基因拷贝。AtRDR3、AtRDR4和AtRDR5分类在基因簇III中，而AtRDR1在基因簇I中、AtRDR2在基因簇II中、AtRDR6在基因簇IV中。其它物种的直向同源RDR基因也相应分类。属于RDR1簇(基因簇Ⅰ)、RDR2簇(基因簇II)，以及RDR6簇(基因簇IV)的植物基因可通过在所编码的蛋白质的推定催化结构域中的高度保守的共同DLDGD基序而鉴定，这将其与基因簇III的RDR基因区别开，后者含有共同的DFDGD基序。具有DLDGD基序的RDR基因分类在一起成为RDRα类，而具有DFDGD基序的RDR基因属于RDRγ类。在DLDGD基序附近，RDRα类基因还共享一些其他共同的保守基序，这些基因通过这些基序可以很容易地被分类到RDRα类中。想进一步归类到基因簇I、II或IV是比较困难的，因为尽管有共同的基序，RDR基因中还有相当宽范围的序列，即使只考虑RDRα基因的情况下也是如此。然而，本专利技术的RDR基因可归类为RDR1基因。因此本专利技术提供了一种能够对植物赋予抗性和/或增加植物中的病毒抗性的修饰的RDR1基因，所述修饰导致RDR1基因的增强表达，且其中所述修饰选自增加RDR1基因的mRNA水平的修饰；和/或增加RDR1蛋白质水平的修饰；和/或增加RDR1蛋白质活性的修饰。如本文所使用的，所述在特定水平上的增加或活性的增加指的是相比于非修饰的野生型RDR1基因。要获得相关的效应，在mRNA水平上的增加是稳态mRNA水平的增加。稳态的mRNA水平的增加可以由以下情况引起：通过增加mRNA的合成；和/或降低mRNA降解；和/或增加mRNA的稳定性。这里所提到的mRNA水平包括mRNA的积累水平。出人意料的是，该基因的增强表达导致包含所述修饰的基因的植物产生病毒抗性和/或病毒抗性增加。基因赋予针对病原体抗性的机制经常是抗性基因被沉默或表达降低的机制。通过减少其表达的起作用的抗性基因的实例是elf4E基因、DMR6基因、高丝氨酸激酶基因、MLO基因及其他。因此，意想不到的是，本专利技术中的RDR1基因的活性得到实际增强，从而诱导和/或增加针对病毒的抗性。在一个实施方式中，增加RDR1基因的mRNA水平和/或RDR1蛋白质水平和/或RDR1蛋白质的活性的修饰包括在RDR1基因的编码序列的上游的修饰，和/或在RDR1基因的编码基因内的修饰，和/或在RDR1基因的编码序列的下游的修饰。可以以各种方式来实现RDR1基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
修饰的RDR1基因，其能够赋予植物以病毒抗性及/或增加植物中的病毒抗性，所述修饰导致RDR1基因的增强表达，且其中所述修饰选自与非修饰的野生型RDR1基因相比，增加RDR1基因的mRNA水平的修饰；增加RDR1蛋白质水平的修饰；和/或增加RDR1蛋白质活性的修饰。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.04.04 EP 14163639.91.修饰的RDR1基因，其能够赋予植物以病毒抗性及/或增加植物中的病毒抗性，所述修饰导致RDR1基因的增强表达，且其中所述修饰选自与非修饰的野生型RDR1基因相比，增加RDR1基因的mRNA水平的修饰；增加RDR1蛋白质水平的修饰；和/或增加RDR1蛋白质活性的修饰。2.权利要求1中所述的基因，其中所述修饰包含在RDR1基因的编码序列的上游中的修饰。3.权利要求1或2中所述的基因，其中所述修饰是调控元件，优选顺式作用调控元件的修饰。4.权利要求3中所述的基因，其中所述修饰的调控元件选自转录抑制子的转录因子结合位点，对其进行的修饰导致转录抑制的减少或缺失；和/或转录激活子的转录因子结合位点，对其进行的修饰导致转录的诱导或增强；及/或微小RNA结合位点，对其进行的修饰导致基因抑制的减少或缺失；及/或小RNA序列，对其进行的修饰导致基因抑制的减少或缺失。5.权利要求4中所述的基因，其中所述修饰包含顺式作用元件的删除或部分删除，优选地为转录抑制子的转录因子结合位点的删除或部分删除。6.权利要求1-5中任一项中所述的基因，其中所述修饰包含在RDR1基因的启动子中或5’-UTR区域中的修饰，优选地为对启动子中或5’-UTR区域中的顺式作用元件的修饰。7.权利要求6中所述的基因，其中所述修饰是在RDR1基因的5’-UTR区域的外显子中的修饰，优选地为对在5’-UTR区域的外显子中的顺式作用元件的修饰，最优选地在5’-UTR区域的第一外显子中。8.权利要求7中所述的基因，其中所述修饰包含对在RDR1基因的5’-UTR区域的外显子中转录抑制子的转录因子结合位点的删除或部分删除。9.权利要求1-8中任一项中所述的基因，其中所述导致增强表达的修饰包含调控元件的删除或部分删除，所述调控元件包含SEQ ID No.1和/或SEQ ID No.2和/或SEQ ID No.3。10.权利要求1-9中任一项中所述的修饰的RDR1基因，其中所述RDR1基因的野生型序列由SEQ ID No.4(黄瓜)、SEQ ID No.8和21(胡萝卜)、SEQ ID No.9和20(番茄)、SEQ ID No.10和19(西瓜)、SEQ ID No.11和22(甜瓜)、SEQ ID No.12和27(菠菜)、SEQ ID No.13和23(菜豆)、SEQ ID No.14和29(菠菜)、SEQ ID No.15和28(甜菜)、SEQ ID No.16和24(莴苣)、SEQ ID No.17和26(甘蓝)或SEQ ID No.18和25(莴苣)所示。11.权利要求1-10中任一项中所述的基因，其中所述修饰的RDR1基因能够对其中存在该修饰的RDR1基因的植物赋予和/或增加病毒抗性。12.权利要求1-11中任一项中所述的基因，其中所述修饰的RDR1基因能够对其中存在该修饰的RDR1基因的植物赋予和/或增加对单链RNA病毒，优选对正单链RNA病毒的抗性。13.权利要求1-12中任一项中所述的基因，其中所述修饰的RDR1基因能够对其中存在该修饰的RDR1基因的植物赋予和/或增加对马铃薯Y病毒科家族和/或帚状病毒科家族的一种或多种病毒的抗性。...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·M·P·梵邓恩，S·穆瓦赫迪，J·德居德，R·J·J·M·福瑞基特，C·哈林，E·C·J·巴尔，
申请(专利权)人：瑞克斯旺种苗集团公司，
类型：发明
国别省市：荷兰;NL