一种青蒿HD-ZIP IV类转录因子编码序列及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种青蒿HD‑ZIP IV类转录因子编码序列，该编码序列记为AaHD1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。利用转基因技术将青蒿AaHD1转录因子超表达载体转化青蒿可以有效调控青蒿表皮的腺毛密度，从而提高青蒿素的含量。在非转基因普通青蒿的叶片表皮腺毛密度为15个每平方毫米，超表达AaHD1基因表达的转基因青蒿的叶片腺毛密度提高到25个每平方毫米。与之对应的青蒿素含量从非转基因青蒿的9mg/g DW提高到13mg/g DW，该发明专利技术对于为青蒿素的规模化生产提供高产、稳定新药源具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种青蒿HD-ZIPIV类转录因子编码序列及应用。
技术介绍
植物新陈代谢分为初生代谢和次生代谢，初生代谢产物(如糖类、脂类和核酸)存在于所有植物中，是维持细胞生命活动所必需的，而植物次生代谢产物是指植物中一大类并非植物生长发育所必需的小分子有机化合物，其产生和分布具有种属、组织器官和生长发育特异性。大多数植物叶片表面并不是光滑的，而是具有许多类型的毛状结构。根据其功能和形态分为两大类：一类是不具有分泌功能的纤毛；另一类是具有分泌功能的腺毛。前一类的主要代表是棉花的棉纤维，它是棉花种子表皮特化的单细胞纤毛。而分泌型腺毛是植物表皮细胞特化出的一种多细胞结构，近年来对腺毛的研究发现，许多有价值的次生代谢产物都是在这一结构中特异性合成和储存。比如以薄荷精油，玫瑰精油为代表的一大类天然香精香料；以青蒿素为代表的中草药有效成分；以啤酒花为代表的天然植物添加剂。在天然植株中产生的次生代谢产物含量极低，而使用化学合成的方法，工艺流程复杂、成本高，并且很多次生代谢产物添加到食品化妆品行业，使用天然的植物材料更加安全。因此，研究人员开始探索其他的提高植物次生代谢产物含量的方法，在诸多方法之中，提高腺毛密度被认为是一种直接有效的方法。在腺毛中特异性合成的次生代谢产物有个共同的特点，即参与这些次生代谢产物合成的关键酶基因只在腺毛中特异表达。因此，利用基因工程的方法调控腺毛密度是颇具应用价值的植物遗传操作手段。近年来，在非分泌型的单细胞腺毛发育调控中，研究人员已经取得了很多成果。比如，在模式植物拟南芥中，单细胞纤毛的发育调控机制已经基本清楚。在有重要经济价值的棉花中，单细胞纤毛(棉纤维)的发育调控机制也取得了很多的研究成果。而在次生代谢领域，关于分泌型腺毛的报道还比较少。特别是在传统中草药青蒿的研究中，研究主要集中在对合成关键酶基因的转录调控方面，还没有调控腺毛密度的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足,提供一种青蒿AaHD1蛋白编码序列，该基因编码HD-ZIPIV类转录因子(AaHD1)，它参与调控青蒿腺毛的密度；利用转基因技术将青蒿AaHD1转录因子超表达载体转化青蒿可以有效调控青蒿表皮的腺毛密度，从而提高青蒿素的含量。在非转基因普通青蒿的叶片表皮腺毛密度为15个每平方毫米，超表达AaHD1基因表达的转基因青蒿的叶片腺毛密度提高到25个每平方毫米。与之对应的青蒿素含量从非转基因青蒿的9mg/gDW提高到13mg/gDW，该专利技术对于为青蒿素的规模化生产提供高产、稳定新药源具有重要意义。本专利技术是通过以下的技术方案实现的：本专利技术提供了一种青蒿HD-ZIPIV类转录因子编码序列，所述编码序列记为AaHD1，所述AaHD1的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。本专利技术还提供了一种多肽，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。本专利技术还提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体包含如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。本专利技术还提供了一种重组表达转化体，所述重组表达转化体包含如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。本专利技术还提供了青蒿HD-ZIPIV类转录因子编码序列AaHD1在提高青蒿素含量中的应用。进一步地，所述应用包括以下步骤：步骤1、将青蒿HD-ZIPIV类转录因子编码序列AaHD1连于植物表达调控序列上，构建含所述青蒿HD-ZIPIV类转录因子编码序列的植物表达载体；步骤2、将步骤1中的所述植物表达载体转入农杆菌，将所述农杆菌转入青蒿；步骤3、通过抗生素筛选，获得含有所述青蒿HD-ZIPIV类转录因子编码序列AaHD1的转化细胞，再生转基因植株。进一步地，在上述步骤2中，采用冻融法进行转入。本专利技术还提供了一种提高青蒿中青蒿素含量的方法，所述方法包括如下步骤：步骤1、对青蒿栽培种H-ZIPIV类转录因子分析，从青蒿cDNA文库中克隆得到青蒿HD-ZIPIV类转录因子AaHD1；步骤2、将AaHD1基因可操作性地连接于表达调控序列，形成含所述AaHD1基因的植物超表达载体；步骤3、将含所述AaHD1基因的植物超表达载体转化根癌农杆菌，获得具有所述植物超表达载体的根癌农杆菌菌株；步骤4、利用所述根癌农杆菌菌株转化青蒿，经潮霉素筛选得到抗性苗，再经PCR检测为阳性的植株即为转基因青蒿苗；步骤5、对获得的转基因青蒿进行腺毛密度分析，获得腺毛密度显著提高的转基因青蒿，进而获得青蒿素含量提高的青蒿植株。进一步地，所述根癌农杆菌为EHA105。进一步地，步骤4中，所述的经PCR检测的转基因青蒿植株是指，分别设计合成AaHD1基因的检测引物，进行DNA扩增，紫外线下观察到目的条带的阳性株系即为转基因青蒿植株，所述的腺毛密度检测是指在荧光显微镜下，青蒿分泌型腺毛在特定波长下显示明亮荧光，经拍照后再统计其数量和密度。其中，对获得的转基因青蒿中青蒿素含量进行HPLC-ELSD测定。本专利技术从青蒿中克隆AaHD1基因，构建含AaHD1基因的植物超表达载体，用根癌农杆菌介导，采用叶盘法将AaHD1基因超表达载体转化青蒿；PCR检测外源目的基因AaHD1的整合情况，通过荧光显微镜观察和统计腺毛密度，获得了腺毛密度显著提高的转基因青蒿；高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)测定青蒿中青蒿素含量，表明获得的青蒿表皮腺毛密度显著提高的转基因青蒿中的青蒿素含量也显著提高。在本专利技术中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本专利技术的青蒿AaHD1蛋白多肽时，可以将青蒿AaHD1蛋白编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成青蒿AaHD1蛋白表达载体。如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。以下将结合附图对本专利技术作进一步说明，以充分说明本专利技术的目的、技术特征和技术效果。附图说明通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本专利技术的其它特征、目的和优点将会变得更明显：图1示出了本专利技术较优实施例中定量PCR检测AaHD1-OX青蒿中AaHD1表达量的结果；图2示出了本专利技术较优实施例中用荧光显微镜观察野生型青蒿叶片腺毛的结果；图3示出了本专利技术较优实施例中用荧光显微镜观察AaHD1-OX青蒿叶片腺毛的结果；图4示出了本专利技术较优实施例中的腺毛密度统计结果；*，P<0.01(T检验)；图5示出了本专利技术较优实施例中使用HPLC检测青蒿素含量的结果；*，P<0.01(T检验)。具体实施方式下面结合附图对本专利技术提供的具体实施方式作详细说明。下面对本专利技术的实施例作详细说明：本实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种青蒿HD‑ZIP IV类转录因子编码序列，其特征在于，所述编码序列记为AaHD1，所述AaHD1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.一种青蒿HD-ZIPIV类转录因子编码序列，其特征在于，所述编码序列记为AaHD1，所述AaHD1的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。2.一种青蒿HD-ZIPIV类转录因子编码序列，其特征在于，所述AaHD1编码的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。3.一种多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。5.一种重组表达转化体，其特征在于，所述重组表达转化体包含如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。6.根据权利要求1或2所述的青蒿HD-ZIPIV类转录因子编码序列AaHD1在提高青蒿素含量中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：步骤1、将青蒿HD-ZIPIV类转录因子编码序列AaHD1连于植物表达调控序列上，构建含所述青蒿HD-ZIPIV类转录因子编码序列的植物表达载体；步骤2、将步骤1中的所述植物表达载体转入农杆菌，将所述农杆...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐克轩，陈明慧，颜廷祥，沈乾，潘琪芳，付雪晴，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31