海岛棉GbNAC1在抗黄萎病中的应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体涉及到海岛棉GbNAC1基因在抗黄萎病方面的应用专利申请。所述GbNAC1基因，GenBank ID:KP317496，与植物的黄萎病抗性相关。发明专利技术人发现在植物受到黄萎病菌侵染时，该基因的表达量出现了降低变化，进一步将该基因沉默后，植物的抗黄萎病抗性降低，而该基因超量表达后，植物对抗黄萎病的抗性增加。基于上述特性，可以培育或者筛选GbNAC1超表达植株，可为获得黄萎病抗性较好植物新品种提供较好借鉴和参考，从而在植物新品种培育方面具有较好地应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程
，具体涉及海岛棉GbNAC1基因在抗黄萎病中的应用专利申请。
技术介绍
在植物的生长发育过程中，经常会遭受到各种病原菌或者干旱、高盐、低温等一系列生物与非生物胁迫。这些胁迫通常会导致植物的损伤进而影响到植物的生长发育及产量。转录因子是一类调节基因表达的重要调控基因，在植物抵御逆境胁迫的过程中起着非常重要的作用，通过与目的基因启动子中的特定DNA序列结合以激活或抑制目标基因的转录表达。在植物中存在着大量的编码不同类别转录因子的基因，其中AP2/ERF、bZIP、WRKY、MYB等转录因子与植物的抗逆胁迫反应有关。棉花是一类非常重要的经济作物，在食品、纺织等领域应用相当广泛。相较于玉米和小麦等其他农作物，棉花在耐盐碱和干旱方面的能力比较强，但是却非常容易感染黄萎病。棉花黄萎病（在主要的棉花种植区域中，大丽轮枝菌是棉花黄萎病的主要致病菌）既是一种通过土壤传播的真菌类维管束病害，又是一种传染性病害。棉花被黄萎病菌入侵后，病株由下部叶片开始发生，逐渐向上发展，病叶边缘稍向上卷曲，叶脉间出现不规则的斑块，甚至整个叶片枯焦，脱落成光杆，茎部维管束褐化，花和果实减少。初步统计表明，在棉花产区黄萎病呈逐年加重趋势，但目前仍然缺乏较为有效的防范手段。近年来在陆生植物中发现了系列NAC转录因子，构成了庞大的转录因子家族。NAC转录因子家族的命名来源于矮牵牛的NAM、拟南芥的ATAF1、ATAF2及CUC2的首字母缩写。目前已在拟南芥中确认了117种NAC基因，在水稻、葡萄、杨树、大豆中分别确认了151、79、163种NAC基因，NAC转录因子N端含有高度保守的约150个氨基酸结构域，在植物生长发育、逆境胁迫中起着重要作用。NAC域中包含了5个子域，分别为A、B、C、D、E。A、C、D子域高度保守，且C和D子域含有核定位信号且带正电荷，与DNA结合有关；A可能参与功能二聚体的形成；B和E子域多变，可能是NAC基因功能多样性的原因之一。NAC转录因子的C端为转录调控区，具有激活或抑制靶基因转录的活性。NAC转录因子的C端也存在13个相对保守的基序，分布于不同的NAC亚组中，同一亚组中如C端转录调控区含有丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、谷氨酸等重复出现频率较高的简单氨基酸，这一特性使得同一亚组的NAC转录因子可能具有相似的生物学功能。研究棉花NAC转录因子在抗黄萎病中的作用，有利于棉花品质改良和抗胁迫性研究工作的进一步开展，对其与黄萎病间的作用机制也有必要加以研究，从而为黄萎病的预防和控制提供一定的借鉴和参考。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供海岛棉基因GbNAC1在抗黄萎病中的新应用，利用该新用途，可培育新的抗黄萎病的棉花新品种，从而为棉花黄萎病的预防和控制提供新的途径。本专利技术所采取的技术方案详述如下。海岛棉GbNAC1基因在抗黄萎病中的应用，所述GbNAC1基因，其ORF序列含543bp，GenBankID:KP317496；该基因在细胞中的亚细胞定位在细胞核内；在棉花的根、茎、真叶、子叶、茎尖等组织中均有表达，但在真叶中的表达量最高，而在茎尖中的表达量最低；该基因与植物黄萎病抗性相关；进一步而言，在棉花受到黄萎病侵染时，GbNAC1基因的表达受到抑制，表达量呈现下降。进一步转基因实验表明，在将CbNAC1基因沉默后，植物的黄萎病抗性有所降低，而将该基因超表达后，植物对黄萎病的抗性增强，所述植物具体为棉花或者拟南芥等。本专利技术首先克隆获得了海岛棉GbNAC1基因，并对该基因结构及相关特性进行了深入研究。在对该基因与植物的黄萎病相关性研究时，专利技术人发现在植物受到黄萎病菌侵染时，该基因表达量出现了表达量降低的明显变化，进一步将该基因沉默后，植物的抗黄萎病抗性降低，而该基因超表达后，植物对黄萎病抗性增加。基于上述特性，通过培育或者筛选GbNAC1基因超表达的植株，可为获得黄萎病抗性较好植物新品种提供借鉴和参考，因而在植物新品种培育方面具有较好地应用价值。附图说明图1为GbNAC1基因的克隆和菌液PCR检测的电泳图，其中A：GbNAC1基因的克隆其中M表示Marker，1-2表示2个PCR重复；；B：菌液PCR的检测结果，其中M表示Marker，1-5表示5个单菌落；图2为GbNAC1的同源性序列比对和进化树分析，图A为同源性序列比对结果，其中A-E为5个保守结构域，方框表示与WRKY转录因子家族相似且保守DNA结合结构域；图B为进化树分析结果，其中ANAC061(NP_001118771.1)，ANAC090(NP_197630.1)，TERN(XP_009759500.1)，ONAC012(NP_001055672.1)；图3为GbNAC1与雷蒙得氏棉中的NAC转录因子的进化关系和保守结构域分析，其中黑框和箭头指向GbNAC1；图4为续图3；图5为GbNAC1基因在本氏烟表皮细胞的定位；图6为GbNAC1在转基因拟南芥中的GUS染色分析；图7为黄萎病处理后GbNAC1基因在组织表达中的定量分析；图8为GbNAC1基因在海岛棉新海15中的组织表达模式分析；图9为VIGS干涉植株对黄萎病的抗性分析；其中A：棉花基因cla通过VIGS沉默后的表型；B：TRV:GbNAC1干涉植株的黄萎病抗性；C：发病后茎部解剖图；D：半定量检测基因沉默水平；E：黄萎病菌恢复实验；F：病情指数分析；图10为GbNAC1超表达拟南芥植株的抗黄萎病菌分析。具体实施方式下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，首先对下述实施例中所涉及部分生物材料及实验试剂等情况简要介绍如下。生物材料：棉花材料包括：海岛棉抗黄萎病品种新海15，16，由中国农业科学院棉花研究所杜雄明研究员提供；黄萎病菌株：棉花黄萎病强致病力菌系V991，由中国农业科学院植物保护研究所简桂良研究员提供；拟南芥材料：野生型拟南芥种子(Columbia-0)；由河南大学植物逆境实验室提供（亦可由其他公开渠道获得），培养条件为21℃，16h光照/8h黑暗；烟草材料：本氏烟种子(Nicotianabenthamiana)；由河南大学植物逆境实验室提供（亦可由其他公开渠道获得），培养条件为25℃，14h光照/10h黑暗；其他生物材料包括：大肠杆菌菌种DH5α、农杆菌菌种GV3101；植物超表达载体super-pCAMBIA1300；BP反应入门载体pDONOR221；基因亚细胞定位载体PK7FWG2.0；启动子分析载体pKGWFS7.0；VIGS干涉技术载体pTRV1和pTRV2；上述载体和菌种由河南大学植物逆境实验室提供（亦可由其他公开渠道获得）。实验试剂：反转录试剂盒、pMD18-TVector、T4-DNA连接酶、限制性内切酶EcoRI，KpnI、ExTaq酶、荧光定量PCR试剂盒等均为TaKaRa公司产品；质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自天根公司；荧光定量PCR专用板为Labwares公司产品；RNA提取试剂盒购自AidlabBiotech（Beijing，China）公司；所用培养基及溶液有：LB液体（固体）培养基、YEP液体（固体）培养基、0.6MS培养基、察氏（Czapek）培养基、PDA培养基等，均按本领域常规制备方法制备即可；其他未描本文档来自技高网...

【技术保护点】
海岛棉GbNAC1基因在抗黄萎病中的应用，其特征在于，所述GbNAC1基因，其ORF序列含543bp，GenBank ID: KP317496；该基因与植物的黄萎病抗性相关。

【技术特征摘要】
1.海岛棉GbNAC1基因在抗黄萎病中的应用，其特征在于，所述GbNAC1基因，其ORF序列含543bp，GenBankID:KP317496；该基因与植物的黄萎病抗性相关。2.如权利要求1所述海岛棉转录因子GbNAC1基因在抗黄萎病中的应用，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡应繁，王微娜，杨璨，耿帅鹏，孙全，张骁，宋纯鹏，
申请(专利权)人：河南大学，
类型：发明
国别省市：河南;41