本发明专利技术公开了海岛棉受体类似蛋白激酶基因启动子及其应用，该启动子长度为3183bp，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。受体类似蛋白激酶基因编码蛋白产物与植物胁迫反应的信号传导有关，基因的启动子是一个维管束特异的启动子，受生物和非生物诱导表达，可通过基因工程方法利用该启动子增强目标基因在维管束中表达水平，以改良棉花对黄萎病和非生物胁迫的抗性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及海岛棉受体类似蛋白激酶基因启动子及其应用。
技术介绍
植物基因调控主要是在转录水平上进行的，受多种顺式作用元件和反式作用元件的调控。植物基因启动子是重要的顺式作用元件，是位于结构基因5'端上游区的DNA序列，能指导酶与模板的正确结合，活化RNA聚合酶，并使之具有起始特异性转录的形式，决定转录的方向和效率以及所使用的RNA聚合酶类型，是转录调控的中心。按其作用方式及功能，可将植物基因工程中常用的启动子分为3类，即组成型启动子、组织特异型启动子和诱导型启动子。棉花是重要的经济作物，棉纤维是主要的纺织原料。随着可耕地面积的减少，环境的恶化，棉花的生产受到很多种生物和非生物因子的影响，尤其是我国枯、黄萎病，给棉花生产造成很大的损失。通过传统的育种方法已经很难满足现代农业需求，所以通过基因工程的方法来改良现有品种将是今后育种的主要方法。目前，通过转基因改良农作物，所使用的启动子大多是组成型启动子。常用的组成型启动子有花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子、根癌农杆菌Ti质粒的胭脂碱合酶(N0Q启动子和章鱼碱合酶(0CQ启动子。35S启动子是使用最多最频繁的启动子。由于组成型启动子在转基因作物的不同时期和不同部位均能表达，因此，在转基因作物中也存在一系列问题。Kohli等(1999)的研究表明，CaMV 35S 启动子中有19bp左右的回文序列的重组热点。根据这一结论，Cummins等Q000)和张艳华等Q003)列出CaMV 35S启动子的潜在风险(1)如果35S启动子插入到原来整合到植物基因组中的隐性病毒基因组旁，可能会重新活化病毒；( 如果该启动子插入到某一编码毒素蛋白的基因上游，可能会增强该毒素的合成；C3)当转基因植物被动物或人类食用时，CaMV 35S启动子可能会通过基因的水平插到某一致癌基因上游，活化并且导致癌症的发生。魏伟等000 研究还发现，组成型启动子CaMV35S启动抗虫基因表达，可能会降低棉花植株体内杀虫物质浓度，同时还消耗棉株大量的能量，影响其杀虫效果，甚至导致转基因棉花在正常环境下都会出现生长延滞的现象。因此，寻找特异性或诱导型启动子驱动相关基因的表达，可能有利于上述问题的解决。组织或器官特异性启动子调控下的基因转录一般只发生在某些特定器官或组织中，并往往表现出发育调节的特性。组织特异性启动子启动外源基因在转基因植物中的特定组织中表达，不但可以降低植物耗能、减轻对植物形态和生长发育的影响，还可以提高外源基因在特定部位的表达浓度，增强转基因的效果。与组织器官特异性启动子相比，诱导型启动子有着独特的优点可根据需要在植物特定的发育阶段、组织器官或生长环境下，让其接受诱导信号，诱导目的基因的表达；也可解除胁迫， 让目的基因的表达停止，可快速诱导基因转录的“开”与“关”。采用诱导型启动子使外源基因能够定时、定点、定量地在植物中表达。本专利技术所克隆的是受体类似蛋白激酶的启动子，类受体蛋白激酶(receptor likeprotein kinase,RLKs)属于蛋白激酶的一个亚家族，位于细胞膜上，作为信号分子的受体， 能够感受外界刺激，参与胞内信号转导过程，在植物生长发育过程中起着重要的作用。受体蛋白激酶参与了植物许多由激素和胞外环境信号引起的生理生化过程，如，自交不亲和、调节胚乳和花粉的发育、花的脱落、油菜素类固醇信号反应、环境胁迫及植物抗病等。在已克隆的抗病基因中水稻的)(a21、拟南芥的PBS1、大麦的RPG1、番茄的PTO都含有受体蛋白激酶保守结构域。然而，关于受体蛋白激酶相关基因从启动子结构、功能及作用机制角度上进行阐述，进展缓慢，目前报道较少。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克隆一个海岛棉受体类似蛋白激酶基因((ibRLK) 的启动子序列。采用在线软件Neural Network Promoter Prediction预测转录起始位点 (Transcriptional start site, TSS)，采用 PlantCARE、PLACE 等生物信息学分析软件对启动子区中潜在的顺式调控元件进行预测。根据预测结果发现在-l/_644bp中包含启动子的核心元件，在-644bp/-1476bp中包含一个与病菌诱导相关的顺式调控元件W-box， 在-1467bp之后包含一些其他的响应元件。通过设计三对引物，构建含核心元件和不同调控元件区的三个启动子缺失载体，载体为35S-pCAMBIA1301-N0Rs。按照激酶基因的起始密码子ATG的A为+1，则三个载体包含的序列分别为-l/-644bp，-l/-1476，-l/-1890，并分别将其命名为1301-1，1301-2，1301-3。三个重组载体转化拟南芥，转基因后代经过⑶S染色， 定量检测其在各种生物和非生物胁迫后⑶S活性的变化。同时将pCAMBIA1301 (CaMV 35S) 植物表达载体转化到拟南芥中并筛选获得转基因植株，以此作为对启动子表达活性进行分析的阳性对照。本专利技术公开了一种海岛棉受体类似蛋白激酶基因((ibRLK)启动子，长度为 3183bp，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。从第1313bp至第3183bp(^ 1890bp)为该启动子功能研究涉及的序列，第3183bp后接受体类似蛋白激酶的起始密码子atg。启动子 1890bp区域的分析如下.-1890 AGGTTGGTCTGGCTCGGGATAAAAATTTGAAATGAGAAACTTGGAAAAATTGTTCTTTTG-1830 TTTTGGTTTATTTTTGTAAGGTTTGTGTGAACTGCCTGACAATACTCACCATGGATTATTGATA-BoxGATA-Box- 1 7 7 0 CTTGCTTCTTAG ^Α ^ TAGCAGTATTT ^Α ^ GACAGACAGACAGACAGGTAGGTAATATA-1710 TATATAGGGTAGTAGTTGTTGTGCCCCATCCGTTTAATTGATGTATTCTGTAATTAAAAA-1650 AAATTGCGAAAGAGGGATCTTGCATTTTCTTTATTATTATTACTATTATTATTGACTAAG-1590 GTTTTTTATTCTAAGACTTTAAGGTCTTCGCAAACAAATTTTTTTCCCTTGCATTCCTTTMYC-consensus AGM0TIFNTMYB2-1530 TAAACTTAAC |catctg| GATTTATTAAATGAGTTAAC iagatccaa丨 AGAAACAAACACAATAMYBIAT-1470 AAGTCCCGATTACACAATAATCAAAAAAGAAAATAAAAGGTCGCCTAAAATA Kaacc^ TARoot-motif-1410TGCTTTGAAAACCGCTAAAACTGATG Ktatt| TTAGGAGCTTCAAAATTAATCCTAATTAC-1350CCAGCTGATTTGATCCCAAGTAGCCTCCTCTCTTCATCTTTTATCATTTTTATTTCAGTTBox-fflTCA-elementRoot-motif-1290tctg本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．海岛棉受体类似蛋白激酶基因启动子，长度为３１８３ｂｐ，核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤＮＯ．１所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张天真，赵君，郭旺珍，张朝军，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：84
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