一种蛋白酶抑制剂编码基因及其表达与应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，具体涉及一种来源于菊芋的蛋白酶抑制剂编码基因(HtCPI)及其表达和应用。HtCPI基因碱基序列如SEQ ID NO：1所示；或，与SEQ ID NO：1所示碱基序列同源性在90％以上的基因。本发明专利技术提供的HtCPI基因及其表达载体能用于植物遗传转化，提高植物抗逆性。另外本发明专利技术提供的HtCPI基因能够用于体外表达，在生物源杀虫剂生产方面具有重要应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种来源于菊芋的蛋白酶抑制剂编码基因及其表达和应用。
技术介绍
蛋白酶抑制剂基因广泛分布于植物体内，可以通过抑制昆虫肠中蛋白酶的活性而降低昆虫取食量，抑制昆虫生长甚至杀死昆虫，被作为理想的抗虫因子而广泛研究。它还是干旱、低温及高盐等恶劣环境胁迫下的一种重要的组织防御应激蛋白。半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cysteine proteinase inhibitor，CPI)是一个由进化相关的蛋白所构成的巯基蛋白酶抑制剂亚族，这些蛋白能与半胱氨酸蛋白酶相互作用形成可逆地竞争性结合并抑制其活性。半胱氨酸蛋白酶抑制剂最早是在鸡蛋清中被分离得到，因其对半胱氨酸蛋白酶有抑制作用而被命名为“cystatin”。半胱氨酸蛋白酶抑制剂除了能够有效地调控内源半胱氨酸蛋白酶的水平，还能抑制外源半胱氨酸蛋白酶的活性，阻止宿主细胞受细菌或病毒等病原体的感染。Cystatin对以半胱氨酸类蛋白酶为主要消化酶的鞘翅目昆虫的防治具有重要作用。当半胱氨酸类蛋白酶抑制剂被昆虫摄食并在体内积累时，它与昆虫消化道中的蛋白酶作用形成酶‐抑制剂复合物，而显著降低昆虫肠道内蛋白酶的活性，影响食物中蛋白的正常消化和许多酶原的激活，同时刺激消化酶的过量合成和分泌，扰乱昆虫正常代谢，最终导致昆虫死亡。除抗虫基因工程外，蛋白酶抑制剂在医药、食品领域也有应用价值：在医药领域，蛋白酶抑制剂可用于抗炎抗感染、抗病毒感染和抗肿瘤等临床治疗上，如在治疗胰腺炎和多功能衰竭、抗休克、减少心脏外科手术中失血等方面。在食品领域，蛋白酶抑制剂能够与鱼肉中的蛋白酶争夺活性位点或者非特异性的捕获蛋白酶，干扰蛋白酶的作用，提高鱼肉糜的贮藏性。比较商业化的Bt抗虫基因，植物蛋白酶抑制剂基因应用于抗虫基因工程具有三大明显的优势：(1)它杀虫谱广；(2)昆虫不易对其产生耐受性，其作用位点在酶活性中心，而酶的活性中心在进化上是高度保守的，昆虫难以直接产生抗性；(3)由于作用机制不同，植物蛋白酶抑制剂不影响哺乳动物包括人类消化酶的活性，对人及哺乳动物无害。因此，它的分离、转化十分受到重视。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种来源于菊芋的蛋白酶抑制剂基因及其表达和应用。一种蛋白酶抑制剂编码基因(HtCPI)，其特征在于：HtCPI基因碱基序列如SEQ ID NO：1所示；或，与SEQ ID NO：1所示碱基序列同源性在90％以上的基因。HtCPI基因编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本专利技术HtCPI基因由427个核苷酸组成。本专利技术HtCPI基因编码的蛋白质为半胱氨酸蛋白酶抑制剂，由110个氨基酸残基组成，包括N-端19个氨基酸残基组成的信号肽区和C-端91个氨基酸组成的成熟肽区，其理论等电点为8.99，属于碱性蛋白质，与葡萄半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因(GenBank accession XP003635016)具有最高的序列相似性且仅为39％。本专利技术HtCPI基因编码的蛋白质二级结构中多为α-螺旋，很少的β-折叠，经过比对分析，可归为半胱氨酸蛋白酶抑制剂I25家族B型。菊芋HtCPI基因的制备方法，包括如下步骤：菊芋cDNA文库的构建：选取菊芋块茎提取总RNA，以总RNA为模板，运用Clontech公司SMARTerTM cDNA建库试剂盒合成cDNA双链；以上述cDNA为模板，运用引物进行PCR扩增，获得HtCPI基因片段；上述扩增片段回收后克隆入T载体，测序后获得SEQ ID NO：1所示HtCPI基因。所述引物为F:5’–ATGGCTCAGCCCCTTAGTCTCC-3’；R:5’–CGGGGTACGATGAGACACCA-3’。本专利技术构建了HtCPI基因表达载体，能用于植物遗传转化，在制备抗逆的转基因植物中的应用。植物表达载体为将所述HtCPI基因与pCAMBIA2301载体相连，获得植物表达载体。基因的植物表达载体的构建方法，包括如下步骤：以限制性内切酶XBa Ⅰ和Sac Ⅰ双酶切JaSPI基因加酶切位点的PCR产物和pCAMBIA2301载体；分别回收上述HtCPI基因片段和pCAMBIA2301载体，以5：1的比例连接；通过PCR和酶切对上述重组质粒进行鉴定。HtCPI基因的应用，所述HtCPI基因在制备抗逆的转基因植物中的应用。HtCPI基因表达载体的应用，所述表达载体在制备抗逆的转基因植物中的应用。本专利技术实现的有益效果：蛋白酶抑制剂基因广泛分布于植物体内，可以通过抑制昆虫肠中蛋白酶的活性而降低昆虫取食量，抑制昆虫生长甚至杀死昆虫，被作为理想的抗虫因子而广泛研究。作为抗虫基因其具有三大明显的优势：(1)它杀虫谱广；(2)昆虫不易对其产生耐受性，其作用位点在酶活性中心，而酶的活性中心在进化上是高度保守的，昆虫难以直接产生抗性；(3)由于作用机制不同，植物蛋白酶抑制剂不影响哺乳动物包括人类消化酶的活性，对人及哺乳动物无害。蛋白酶抑制剂基因还是干旱、低温及高盐等恶劣环境胁迫下的一种重要的组织防御应激蛋白。本专利技术从菊芋中克隆了一种新型的蛋白酶抑制剂编码基因HtCPI，属I25家族B型半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因，与葡萄序列相似性最高，但其序列相似性仅为39％。为了进一步分析该基因的作用与功能，采用本专利技术获得基因并构建植物表达载体可见，野生型拟南芥和本专利技术转HtCPI基因的拟南芥在抗虫性上有明显的差异，转HtCPI基因的拟南芥比野生型的植株有明显的抗虫能力，可见HtCPI基因的转入提高了拟南芥植株的抗虫能力。通过本专利技术菊芋HtCPI基因的获得，可以用于植物遗传转化，提高植物的抗虫性及抗逆性。另外本专利技术提供的HtCPI基因能够在体外表达，在生物源杀虫剂生产方面具有重要应用价值。附图说明图1为本专利技术实施例提供的琼脂糖电泳鉴定总RNA产物图谱。图2为本专利技术实施例提供的琼脂糖电泳鉴定PCR扩增产物图谱。图3为本专利技术实施例提供的表达载体构建酶切鉴定图谱。具体实施方式下面通过具体实施例对本专利技术做进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本专利技术的保护范围。菊芋HtCPI基因及其表达载体，是通过以下方法得到：1.菊芋cDNA文库的构建本专利技术取生长健壮的成熟期菊芋块茎，用天根生化科技有限公司植物总RNA提取试剂盒提取总RNA，以总RNA为模板，参照Clontech公司cDNA文库构建试剂盒说明，在反转录酶和聚合酶的作用下合成cDNA双链。2.引物的设计与合成本专利技术设计正向特异性引物：5’-ATGGCTCAGCCCCTTAGTCTCC-3’，反向引物使用cDNA文库建库试剂盒提供的引物：5’–CGGGGTACGATGAGACACCA-3’。引物两端分别引入XBa Ⅰ和Sac Ⅰ酶切位点，引物由上海生物工程技术有限公司合成。3.PCR方法获得HtCPI基因片段本专利技术以合成的高质量cDNA双链为模板，利用步骤2设计的正反向引物扩增HtCPI基因序列。PCR条件为：①95℃，5min；②95℃，30s；58℃，30s；72℃，1min；30个循环；③72℃，10min。4.克隆鉴定与序列测定扩增片段采用北京百泰克公司DNA回收试剂盒回收纯化后，克隆连接到pMD19-T载体中，转化DH5α感受态细胞进行克隆鉴定和序列测定。5.序列分析本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白酶抑制剂编码基因(HtCPI)，其特征在于：HtCPI基因碱基序列如SEQ ID NO：1所示；或，与SEQ ID NO：1所示碱基序列同源性在90％以上的基因。

【技术特征摘要】
1.一种蛋白酶抑制剂编码基因(HtCPI)，其特征在于：HtCPI基因碱基序列如SEQ ID NO：1所示；或，与SEQ ID NO：1所示碱基序列同源性在90％以上的基因。2.按权利要求1所述的HtCPI基因，其特征在于：所述HtCPI基因编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。3.一种权利要求1所述的HtCPI基因的制备方法，其特征在于：菊芋cDNA文库的构建：选取菊芋块茎提取总RNA，以总RNA为模板，运用Clontech公司SMARTerTM cDNA建库试剂盒合成cDNA双链；以上述cDNA为模板，运用引物进行PCR扩增，获得HtCPI基因片段；上述扩增片段回收后克隆入T载体...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨少丽，秦松，任鹏鸿，王义鹏，何俊丽，
申请(专利权)人：中国科学院烟台海岸带研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37