丝氨酸蛋白酶抑制剂‑3及其功能、制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及生物医药技术领域，涉及丝氨酸蛋白酶抑制剂‑3(Serpin‑3)的结构及其获得方法、新的生理功能以及在生物医药领域应用。所述的Serpin‑3全序列的氨基酸及核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。所述的Serpin‑3成熟肽的氨基酸及核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明专利技术还提供了所述重组Serpin‑3的类似物或活性片段。本发明专利技术的天然、重组Serpin‑3及其类似物、部分片段在体内外对丝氨酸蛋白酶、对抗菌肽合成以及对激活酚氧化酶原激活系统具有抑制作用。且本发明专利技术所述的天然、重组Serpin‑3及其部分片段或类似物获得方法常规、简单、产量高。

Serine protease inhibitor 3 and its function, preparation method and Application

The present invention relates to the technical field of biological medicine, relates to the serine protease inhibitor 3 (Serpin 3) structure and methods, new function and application in biomedical field. The Serpin 3 complete sequences of nucleotide and amino acid sequence is shown as SEQ ID NO:1. Amino acid and nucleotide sequence of the Serpin 3 mature peptide is shown as SEQ ID NO:2. The invention also provides the recombinant Serpin 3 analogues or active fragment. The invention of natural and recombinant Serpin 3 and its analogs, fragments of serine proteases, in vitro and in vivo antibacterial peptide synthesis and has inhibitory effect on the activation of the prophenoloxidase activating system. Natural and recombinant Serpin and the 3 and fragment or similar method to obtain routine, simple and high yield.

【技术实现步骤摘要】
丝氨酸蛋白酶抑制剂-3及其功能、制备方法和应用
：本专利技术涉及生物医药
，涉及丝氨酸蛋白酶抑制剂-3的结构及其获得方法、新的生理功能以及在生物医药领域应用。具体地说，本专利技术涉及丝氨酸蛋白酶抑制剂-3及其类似物、活性片段的结构及其制备生产方法与功能，以及其在微生物及其相关分子模式检测诊断、抑制昆虫血淋巴黑色素产生、抑制昆虫合成抗菌肽等生物医药领域中的应用，制备丝氨酸蛋白酶抑制剂-3及其类似物或活性片段抗体及其在生物医药领域的应用。
技术介绍
：丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin)超家族是蛋白酶抑制因子中最大的超家族，种类繁多，分布广泛，具有共同起源且氨基酸序列和空间结构相对保守，但功能却高度分化。绝大多数Serpin主要在生物体内通过抑制蛋白酶活性而起到负向调控作用，然而某些Serpin的功能并不局限于抑制蛋白酶，有些还可作为一种其他功能蛋白的辅蛋白，有些具有抑菌作用。具有抑制活性的Serpin由蛋白质主体和活性中心环两部分组成，分子量约为40～50KDa。Serpin的主体结构域极为保守，通常具有3个β-折叠(命名为A，B，C)和8-9个α螺旋。其中最具有代表性的是A-sheet和活性中心部分。在A-sheet中包含两个β片层，包含了“Breach”和“Shutter”两个部分。Serpin的活性中心环(ReactiveCentreLoop,RCL)主要由位于C末端的约20个氨基酸残基组成，暴露在Serpin的蛋白主体之外，带有能够被靶酶特异识别的位点，称之为P1，从P1的羧基端开始的氨基酸称为P1′。Serpin的作用机制不同于常规酶与底物间的相互作用(锁钥机制)。它通过破坏靶酶的结构而使靶酶完全丧失活性。当Pl和P1靶在酶的作用下断裂时，Serpin首先与靶酶形成共价酯键，即形成酰基酶中间体。经过构型的改变酰基键水解，形成能量低的稳定产物。也有解释称：RCL牵引靶酶转向Serpin的另一侧从而引起靶酶构象改变，因此Serpin型抑制剂也被称为自杀性抑制剂。这一构象变化过程要比蛋白酶水解快几个数量级，所形成的复合物根据其形成的Serpin成员及环境的不同可保持稳定达数周甚至数年，但最终还可分解为有活性的蛋白酶和已断裂的Serpin。同时，有些Serpin的抑制活性还受辅助因子的调控。Serpin是昆虫重要的负向调控因子。据文献报道，果蝇基因组中共含有29个Serpin基因片段，其中已有13个基因得到分离并确认相关功能。例如serpin-27A对于Toll通路具有重要负调控。2003年Hashimoto等人发现，当果蝇受到真菌侵染时，细胞外的Serpin43Ac会调节Toll途径对其做出反应。2004年Riche等人发现果蝇Serpin4A是一种细胞内丝氨酸蛋白酶抑制剂，在细胞分泌途径中起着调节的作用。美国白蛾血浆中发现一种可抑制酚氧化酶原激活系统的Serpin。而烟草天蛾的Serpin-1基因经可变剪切可产生12种蛋白形式，其中，serpin-7、serpin-6、serpin-3和serpin-1J可抑制PAP-3的活性；Serpin-5可调节HP6、proHP8和proPAP1的活性；Serpin-4对于HP6具有抑制作用。在黄粉虫中，SPN-40、SPN-55和SPN-48可分别特异性抑制SP级联中的三种丝氨酸蛋白酶来调节Toll信号通路和酚氧化酶级联反应。经序列分析及生物学功能研究表明，果蝇SPN-43Ac、黄粉虫SPN48以及烟草天蛾Serpin-3序列同源性较高(在此统一命名为Serpin-3)，且生物学功能相似，均参与调节先天性免疫信号通路中丝氨酸蛋白酶级联系统。因此，对于Serpin-3抑制底物及其抑制机制的研究，为深入了解先天性免疫信号调节机制具有重要的研究意义。目前尚未见对鳞翅目(Lepidoptera)的天(大)蚕蛾科昆虫Serpin-3的结构、制备、生物学功能以及功能应用的研究。
技术实现思路
：本专利技术所解决的技术问题是提供一系列Serpin-3及其制备方法。所述的Serpin-3全序列的氨基酸及核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。所述的Serpin-3成熟肽的氨基酸及核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。本专利技术还提供了所述重组Serpin-3的类似物或活性片段。所述的Serpin-3类似物或活性片段为包括SEQIDNO：1的氨基酸序列，如SEQID：3-16所示。本专利技术进一步提供了所述天然Serpin-3、重组Serpin-3及其类似物或活性片段，以天然Serpin-3、重组Serpin-3及其类似物或活性片段作为抗原的抗体在生物领域中的应用，包括1.针对微生物的预防、检测诊断、治疗等生物医药领域应用；2.针对微生物相关分子模式的预防、检测诊断、治疗等生物医药领域应用；3.针对Serpin-3、重组Serpin-3、重组Serpin-3类似物或活性片段的检测与追踪等生物医药领域应用；4.通过其抑制鳞翅目天(大)蚕蛾科昆虫的酚氧化酶原激活系统以及抗菌肽的合成，从而抑制鳞翅目天(大)蚕蛾科昆虫的免疫防御系统，提高鳞翅目的天(大)蚕蛾科昆虫的抗微生物能力；5.其对丝氨酸蛋白酶强烈的抑制活性的特点，且不易产生耐药性，可以作为制备肿瘤、胃炎、胰腺炎、癌症等疾病的药物应用。本专利技术是针对鳞翅目的天(大)蚕蛾科昆虫体内的Serpin-3，研究天然Serpin-3的制备方法、一级结构(基因和蛋白质)、生物学功能以及其应用，利用基因工程技术获得重组Serpin-3及其类似物或活性片段以及其生物学功能和应用。此外，利用天然、重组Serpin-3及其类似物或活性片段作为抗原，刺激机体产生抗体，同时研究了该抗体的应用。本专利技术是通过如下技术方案实现的：首先利用蛋白提取、分离、纯化技术，从鳞翅目天(大)蚕蛾科昆虫中分离、纯化获得天然Serpin-3。其次，利用蛋白质化学技术以及分子生物学技术，解析Serpin-3的一级结构(基因和蛋白质)并获得其基因。再次，利用基因工程技术，实现Serpin-3基因在宿主细胞的表达，结合蛋白提取、分离、纯化技术获得重组Serpin-3。同时，利用基因重组技术，获得Serpin-3的类似物或部分片段。天然、重组Serpin-3以及其类似物或部分片段，能够特异性抑制丝氨酸蛋白酶的活性，这种抑制作用一方面能够抑制昆虫体液免疫中的酚氧化酶原激活系统，另一方面抑制昆虫细胞免疫而降低抗菌肽的合成。本专利技术的天然、重组Serpin-3以及其类似物或部分片段以及其抗体的生物学功能，可广泛应用于针对微生物的预防、检测诊断、治疗；鳞翅目天(大)蚕蛾科昆虫的抗病以及针对基于丝氨酸蛋白酶抑制作用的肿瘤、胃炎、胰腺炎、癌症等疾病的治疗。本专利技术的Serpin-3，其氨基酸序列如SEQID：1所示。其制备方法如下：一、天然Serpin-3的制备本专利技术所获得天然Serpin-3是通过如下技术方案实现的，包括：以昆虫血淋巴作为原料，通过亲和层析、疏水层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、盐析、超滤或上述方法的不同组合，分离纯化得到不同纯度乃至电泳纯或HPLC纯的Serpin-3。其中，昆虫血淋巴(简称血淋巴)，是昆虫血液(或血细胞裂解物)和淋巴液的混合物或/和昆虫压榨或匀浆的体液，用缓冲溶液或酸性溶本文档来自技高网...

【技术保护点】
天然丝氨酸蛋白酶抑制剂‑3，其特征在于：氨基酸及核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.天然丝氨酸蛋白酶抑制剂-3，其特征在于：氨基酸及核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。2.如权利要求1所述的天然丝氨酸蛋白酶抑制剂-3，其特征在于：成熟肽的氨基酸及核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。3.天然丝氨酸蛋白酶抑制剂-3或重组丝氨酸蛋白酶抑制剂-3、重组丝氨酸蛋白酶抑制剂-3类似物或活性片段，其特征在于：包含SEQIDNO：1所示的序列或全序或片段；优选：Met-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3成熟肽氨基酸序列、Met-组氨酸标签-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3成熟肽氨基酸序列、Met-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3成熟肽-His6标签氨基酸序列、Met-His6标签-凝血酶酶切位点-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3成熟肽氨基酸序列、Met-GST标签-凝血酶酶切位点-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3成熟肽氨基酸序列、Met-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3成熟肽-凝血酶酶切位点-GST标签氨基酸序列、Met-His6标签-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3全序列氨基酸序列、Met-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3全序列-His6标签氨基酸序列、Met-GST标签-凝血酶酶切位点-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3全序列氨基酸序列、Met-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3全序列-凝血酶酶切位点-GST标签氨基酸序列、Met-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3成熟肽-Flag标签氨基酸序列、Met-Flag标签-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3成熟肽氨基酸序列、Met-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3全序列-Flag标签氨基酸序列、Met-Flag标签-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3全序列氨基酸序列。4.如权利要求1所述的天然丝氨酸蛋白酶抑制剂-3的制备方法，其特征在于：利用鳞翅目天蚕蛾科昆虫的血淋巴，以昆虫血液或血细胞裂解物和淋巴液的混合物或/和昆虫压榨或匀浆的体液作为分离纯化的原料液；该原料液经过单独的离子交换层析或疏水层析或亲和层析或凝胶过滤或盐析或超滤分离纯化丝氨酸蛋白酶抑制剂-3；再通过离子交换层析、疏水层析、亲和层析、凝胶过滤、盐析或超滤分离纯化方法中的两个或多个的组合以及其分离纯化方法顺序的重排组合，分离纯化获得纯度达到电泳纯乃至HPLC纯度的丝氨酸蛋白酶抑制剂-3。5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的离子交换层析、疏水层析、亲和层析、凝胶过滤、盐析或超滤方法中(1)操作温度在0℃-45℃，优选0℃-10℃；(2)溶液的酸碱度在pH2-pH10，优选pH4-pH9；(3)调节溶液酸碱度的试剂为是常规、通用的酸、碱、酸溶液或碱溶液，酸或酸溶液优选HCl、HAc、磷酸、柠檬酸、硫酸、硼酸或它们的溶液，碱或碱溶液优选NaOH、KOH、Tris、柠檬酸钠或钾盐、磷酸钠或钾盐、硼砂或它们的溶液；(4)缓冲液是常规、通用缓冲离子对缓冲液，优选柠檬酸根缓冲离子对、HCl-Tris缓冲离子对、柠檬酸根-磷酸根缓冲离子对、磷酸根缓冲离子对、醋酸根缓冲离子对、硼酸根缓冲离子对、硼酸-Tris缓冲离子对或上述各缓冲离子的组合；(5)溶液或缓冲液的离子强度在0.001mol/L-0.5mol/L...

【专利技术属性】
技术研发人员：张嵘，张景海，吴春福，
申请(专利权)人：沈阳药科大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21