抑癌丝氨酸－苏氨酸激酶11真核表达载体及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种抑癌基因丝氨酸－苏氨酸激酶11真核表达载体及其构建方法，表达载体为pCMV‑LKB1，基因序列为SEQ ID NO：NM_000455.4；构建方法包括：通过提取293‑T细胞的总RNA、反转录成cDNA，设计引物，PCR扩增目的片段和PCR产物行琼脂糖凝胶电泳后回收目的片段获取LKB1目的片段；pCMV‑blank质粒的扩增和提取；克隆载体pMD18‑LKB1；重组真核表达载体pCMV‑LKB1。本发明专利技术构建抑癌基因丝氨酸－苏氨酸激酶11真核表达载体pCMV‑LKB1，其表达产物可抑制肿瘤的转移、侵袭，能稳定表达抑癌基因LKB1产物，用于肿瘤的辅助治疗。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程
，尤其涉及一种抑癌丝氨酸－苏氨酸激酶11真核表达载体及其构建方法。
技术介绍
已检索的文献中只有LKB1瞬时表达的研究，没有稳定表达LKB1研究文献。本专利技术应用经典分子生物学与细胞生物学技术，主要有RT-PCR、分子克隆、酶切、基因重组、真核表达载体构建、脂质体转染、稳定表达细胞株的筛选以及抗肿瘤相关实验。以下是检索到的与本专利技术相关的研究。解晓晨等在《hLKB1基因重组质粒构建及蛋白表达和定位》(解剖科学进展,2012，18(4):320～322)中构建了pCDNA3.1/flag-hLKB1真核表达载体，将构建的重组质粒转染到胃癌SGC-7901细胞中,分别利用Westernblot和激光共聚焦扫描显微技术检测其表达和在胃癌细胞中的定位，没有进行LKB1对肿瘤细胞的功能检测。张志强等在《LKB1对胰腺癌细胞迁移侵袭及上皮间质转化的影响及机制研究》(实用癌症杂志，2016，31(3):362-365)中将沈阳万类公司购买的pCDNA3.1-LKB1质粒转染至人胰腺癌细胞ASPC-1，检测细胞转染后LKB1蛋白的表达水平，LKB1对人胰腺癌细胞ASPC-1迁移、侵袭能力的影响，LKB1过表达对AMPKa、P-AMPKa及上皮间质转化相关蛋白E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)表达的影响。该研究主要研究了LKB1瞬时表达对人胰腺癌细胞ASPC-1的影响及作用机制，不能确定能否在肿瘤细胞中稳定表达及作用如何。唐乔乔等在《慢病毒介导的LKB1基因在子宫内膜癌HEC.1A细胞中的表达》(中国癌症防治杂志，2014，6(2)：133-136)中构建慢病毒表达载体LKB1/pWP，用包装成功后的病毒液感染子宫内膜癌HEC-1A细胞，以荧光定量PCR、Westemblot法检测HEC-1A细胞中LKB1的相对表达量，没有检测其功能如何。包传恩等在《LKB1协同二甲双胍影响宫颈癌HeLa细胞的增殖与凋亡及其可能的机制》(中国肿瘤生物治疗杂志，2014，21(2)153-159)中构建含有LKB1基因的重组质粒LKB1-pEGFP-nl并转染HeLa细胞，MTI检测LKB1基因对经二甲双胍处理的HeLa细胞增殖的影响，流式细胞术检测对细胞周期和凋亡的影响，相关蛋白AMPK、ACC和Rb磷酸化水平的影响，该研究也没有对LKB1的功能进行检测。以上都是在瞬时表达状态下进行的相关研究，瞬时表达主要是载体本身携带的启动子发挥作用，一般在48小时后即不表达，不能确定能否在肿瘤细胞中稳定表达。而抗肿瘤要经较长时间才能观察到其作用效果，因此建立起LKB1的稳定表达细胞株，对进行抗肿瘤的研究与应用才具有临床意义和应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种抑癌丝氨酸－苏氨酸激酶11真核表达载体及其构建方法，旨在解决目前只有LKB1瞬时表达的研究，没有有效的方法建立起LKB1的稳定表达细胞株的问题。本专利技术是这样实现的，一种抑癌丝氨酸－苏氨酸激酶11真核表达载体，所述抑癌丝氨酸－苏氨酸激酶11真核表达载体为pCMV-LKB1，基因序列为SEQIDNO：NM_000455.4。本专利技术的另一目的在于提供一种所述抑癌丝氨酸－苏氨酸激酶11真核表达载体的构建方法，所述构建方法包括：步骤一，通过提取293-T细胞的总RNA、反转录成cDNA、设计引物PCR扩增目的片段和PCR产物行琼脂糖凝胶电泳后回收目的片段获取LKB1目的片段；步骤二，pCMV-blank质粒的扩增和提取；步骤三，克隆载体pMD18-LKB1；步骤四，重组真核表达载体pCMV-LKB1。进一步，所述提取293-T细胞的总RNA的方法包括：将培养好的贴壁细胞用PBS清洗；按照每25cm2生长面积加入1ml的TRizol，使裂解液均匀分布于细胞表面；用无RNA酶的枪头反复吹打细胞，使之裂解充分；将细胞裂解液转移至无RNA酶的EP管中，室温静置5min，使RNA从核蛋白中分离出来；向裂解液中加入1/5所用TRizol体积的氯仿，反复颠倒混匀，使溶液呈乳白色，室温静置5min；12000r/min4℃离心15min，将裂解液分为明显的三层，吸取上层清液转移至另外一只新的不含RNA酶的EP管中；向新管中加入0.5倍TRizol体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀室温静置10分钟；12000r/min4℃离心10分钟后，试管底部会出现少许白色RNA沉淀；弃去上清液，加入1ml75％的乙醇，使RNA漂浮起来，7500r/min离心5min，弃上清；打开离心管盖，室温干燥沉淀几分钟，加入RNase-free水溶解RNA沉淀，-20℃保存备用。进一步，所述PCR产物行琼脂糖凝胶电泳后回收目的片段方法包括：制胶，称取琼脂粉倒入锥形瓶中，按照0.5％w/v的比例加入1×TAE溶液；微波炉高火加热溶解琼脂粉，每次1min，重复3次，直至完全溶解；取出锥形瓶室温冷却至50℃左右，向琼脂糖凝胶中滴入溴化乙锭溶液，终浓度为0.5ug/ml；将制胶梳子插于制胶模板中，使梳子底部与模板有2mm间隙，将溶解充分的胶缓慢均匀倒入模板中，室温冷却30min，使琼脂糖凝胶冷却成型，取下凝胶切割成适当大小，保存于TAE溶液中；电泳，制好的胶放入电泳槽中，将PCR产物与上样缓冲液按比例混和均匀后点入加样孔，并将5ulDNAMarker加于胶最左边的孔；设置电压为120V，电泳20min；取出凝胶于紫外线投射仪下切取目的片段。进一步，所述胶回收目的片段方法包括：将切取的含目的片段的凝胶放于一只洁净EP管中，称取凝胶质量并换算成凝胶体积，100mg＝100ul，加入3倍于凝胶体积的BufferDE-A溶液；将含有凝胶的溶液放于75℃水浴锅中加热融化，加热过程中每隔2-3min颠倒混匀EP管，使受热均匀，加快溶解速度；加入0.5BufferDE-A体积的BufferDE-B溶液，反复颠倒使二者充分混匀；将混合液分批次加入制备管中，12000g离心1min，弃滤液；将制备管放回离心管，加500ulBufferW1，12000g离心30s，弃滤液；将制备管放回离心管，加700ulBufferW2，12000g离心30s，弃滤液。重复一次；⑦将制备管放回离心管，12000g离心1min；将制备管置于新的洁净的EP管中，在膜上滴加20ul去离子水，室温静置1min，12000g离心1min洗脱DNA目的片段。进一步，所述pCMV-blank质粒的扩增和提取具体包括：扩增质粒：将冻存的含真核表达载体pCMV-blank的菌株由冰箱取出，室温溶解；取200ul冻存菌液，加入Kana的LB溶液中；37℃振荡培养箱过夜培养16h；提取质粒：向吸附柱CP4中加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体，将吸附柱重新放回收集管中；取15ml培养16h的菌液进行离心，12000rpm离心1min，弃上清并用枪头小心吸干上清液，获细菌沉淀；加500μl溶液P1至有菌体沉淀的离心管中，并将细菌沉淀用移液枪彻底悬浮；加入500μl溶液P2至上述离心管中，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解；加入700μ本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抑癌丝氨酸－苏氨酸激酶11真核表达载体，其特征在于，所述抑癌丝氨酸－苏氨酸激酶11真核表达载体为pCMV‑LKB1，基因序列为SEQ ID NO：NM_000455.4。

【技术特征摘要】
1.一种抑癌丝氨酸－苏氨酸激酶11真核表达载体，其特征在于，所述抑癌丝氨酸－苏氨酸激酶11真核表达载体为pCMV-LKB1，基因序列为SEQIDNO：NM_000455.4。2.一种如权利要求1所述抑癌丝氨酸－苏氨酸激酶11真核表达载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：步骤一，通过提取293-T细胞的总RNA、反转录成cDNA、设计引物PCR扩增目的片段和PCR产物行琼脂糖凝胶电泳后回收目的片段获取LKB1目的片段；步骤二，pCMV-blank质粒的扩增和提取；步骤三，克隆载体pMD18-LKB1；步骤四，重组真核表达载体pCMV-LKB1。3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述提取293-T细胞的总RNA的方法包括：将培养好的贴壁细胞用PBS清洗；按照每25cm2生长面积加入1ml的TRizol，使裂解液均匀分布于细胞表面；用无RNA酶的枪头反复吹打细胞，使之裂解充分；将细胞裂解液转移至无RNA酶的EP管中，室温静置5min，使RNA从核蛋白中分离出来；向裂解液中加入1/5所用TRizol体积的氯仿，反复颠倒混匀，使溶液呈乳白色，室温静置5min；12000r/min4℃离心15min，将裂解液分为明显的三层，吸取上层清液转移至另外一只新的不含RNA酶的EP管中；向新管中加入0.5倍TRizol体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀室温静置10分钟；12000r/min4℃离心10分钟后，试管底部会出现少许白色RNA沉淀；弃去上清液，加入1ml75％的乙醇，使RNA漂浮起来，7500r/min离心5min，弃上清；打开离心管盖，室温干燥沉淀几分钟，加入RNase-free水溶解RNA沉淀，-20℃保存备用。4.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述PCR产物行琼脂糖凝胶电泳后回收目的片段方法包括：制胶，称取琼脂粉倒入锥形瓶中，按照0.5％w/v的比例加入1×TAE溶液；微波炉高火加热溶解琼脂粉，每次1min，重复3次，直至完全溶解；取出锥形瓶室温冷却至50℃左右，向琼脂糖凝胶中滴入溴化乙锭溶液，终浓度为0.5ug/ml；将制胶梳子插于制胶模板中，使梳子底部与模板有2mm间隙，将溶解充分的胶缓慢均匀倒入模板中，室温冷却30min，使琼脂糖凝胶冷却成型，取下凝胶切割成适当大小，保存于TAE溶液中；电泳，制好的胶放入电泳槽中，将PCR产物与上样缓冲液按比例混和均匀后点入加样孔，并将5ulDNAMarker加于胶最左边的孔；设置电压为120V，电泳20min；取出凝胶于紫外线投射仪下切取目的片段。5.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述胶回收目的片段方法包括：将切取的含目的片段的凝胶放于一只洁净EP管中，称取凝胶质量并换算成凝胶体积，100mg＝100ul，加入3倍于凝胶体积的BufferDE-A溶液；将含有凝胶的溶液放于75℃水浴锅中加热融化，加热过程中每隔2-3min颠倒混匀EP管，使受热均匀，加快溶解速度；加入0.5BufferDE-A体积的BufferDE-B溶液，反复颠倒使二者充分混匀；将混合液分批次加入制备管中，12000g离心1min，弃滤液；将制备管放回离心管，加500ulBufferW1，12000g离心30s，弃滤液；将制备管放回离心管，加700ulBufferW2，12000g离心30s，弃滤液；重复一次；将制备管放回离心管，12000g离心1min；将制备管置于新的洁净的EP管中，在膜上滴加20ul去离子水，室温静置1min，12000g离心1min洗脱DNA目的片段。6.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述pCMV-blank质粒...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈新年，陈逸轩，李娟，娄丽丽，陈文莉，刘燕，
申请(专利权)人：兰州大学，
类型：发明
国别省市：甘肃;62