能应用于互作蛋白筛选的在植物细胞中完整表达的改造的DH5α BirA基因及其构建方法技术

本发明专利技术公开一种能在植物细胞中完整表达的改造的DH5αBirA基因，所述改造的DH5αBirA基因与野生的DH5αBirA基因的差异在于第118位氨基酸(由R变成G)，以及剪接识别位点的AG区域。还公开一种重组真核表达载体，其包含如前所述的改造的DH5αBirA基因。还公开一种如前所述的重组真核表达载体的构建方法，其包括以下步骤：获得野生的DH5αBirA基因；对所述野生的DH5αBirA基因的第352位碱基的突变，以及对可变剪接的剪切位点进行点突变，以获得能完整表达的改造的DH5αBirA基因，命名为BirAG基因。所述改造的BirAG基因及其构建方法为检测蛋白质相互作用技术实现条件。本发明专利技术改造的BirAG基因能在植物细胞中完整表达，与目的基因融合后在植物中表达可以生物素化与目的基因互作的植物蛋白。本发明专利技术是一种有效的筛选植物互作蛋白的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种真核表达载体构建技术，尤其涉及一种能在真核细胞中完整表达的改造的DH5αBirA基因及其构建方法，以及改造后的BirAG基因在植物蛋白生物素化中的应用和在筛选植物互作蛋白中的应用。
技术介绍
大肠杆菌存在着生物素连接酶BirA，它能将靶标蛋白生物素化，使其带上生物素标记。BirA主要是利用了biotin-N-hydroxysuccinimide或类似的一些酰化物，通过生物素依靠的羧化酶和磷酸戊糖途径中的脱羧酶(Chapman-Smithetal.,1999)，对蛋白的氨基酸基团进行修饰。该酶十分专一，在大肠杆菌中，只能生物素化几个特定的蛋白质。研究人员发现，如果将BirA的第118位的(R)突变成甘氨酸(G)，这种BirA突变体(BirA*)的亲和能力会比野生型的BirA低很多(Kwonetal.,2000)，导致的结果是BirA*可以生物素化在空间上与之靠近的蛋白，尤其是相互作用的蛋白(Choi-Rheeetal.,2004；Cronan,2005)，可以利用BirA*这一特性来检测生物体中蛋白互作的情况。目前该技术已被成功应用于原核生物、哺乳动物、人等细胞中(GuptaGDetal.,2015；Firat-KaralarENetal.,2015；BatsiosPetal.,2016)。以大肠杆菌DH5α菌种为材料，克隆了DH5αBirA片段，并构建了DH5αBirA*片段，检测发现，DH5αBirA*在高等生物中的表达是存在可变剪接现象的，且剪切区域位于BPL_lipA/B蛋白结构域，这对DH5αBirA*在细胞中发挥作用造成影响。
技术实现思路
本专利技术的目的是，通过基因工程技术，对野生的DH5αBirA基因或DH5αBirA*基因进行改造，使之能在真核细胞中完整表达，并确定改造后的突变体可以在植物中工作，并应于互作蛋白的筛选。为达到以上技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：首先，提供一种能在植物细胞中完整表达的改造的DH5αBirA基因，所述改造的DH5αBirA基因与野生的DH5αBirA基因的差异在于编码第118位氨基酸的序列以及剪接识别位点的AG区域。优选地，所述改造的DH5αBirA基因能在水稻细胞中完整表达。更优地，所述改造的DH5αBirA基因序列为SEQIDNo.1所示。其次，提供一种重组真核表达载体，其包含如前所述的改造的DH5αBirA基因。可选择地，所述真核表达载体为pCAMBIA1390载体、pUbi载体或pUbi-EGFP载体。再次，提供一种如前所述的重组真核表达载体的构建方法，其包括以下步骤：获得野生的DH5αBirA基因；对所述野生的DH5αBirA基因的可变剪接的剪切位点进行点突变，以获得能完整表达的改造的DH5αBirA基因。优选地，对所述野生的DH5αBirA基因的可变剪接的剪切位点进行点突变之前，对所述野生的DH5αBirA基因进行点突变以获得突变的DH5αBirA*基因。具体地，对所述野生的DH5αBirA基因第352位碱基进行点突变使所编码的蛋白质的第118为甘氨酸，以获得突变的DH5αBirA*基因。进一步地，对所述野生的DH5αBirA基因进行剪切位点的点突变和/或第352位碱基的点突变之后，将已进行点突变的片段进行特异性扩增，与未进行点突变的扩增片段进行连接，以获得所述改造的DH5αBirA基因。更进一步地，将所述方法改造的BirAG基因与增强启动子的基因序列、待研究的蛋白的基因序列进行连接，以形成所述待研究的蛋白质的蛋白互作研究载体。还提供一种植物细胞中蛋白质互作的检测方法，其采用如前所述的能在植物细胞中完整表达的改造的DH5αBirA基因，或采用如前所述的重组真核表达载体。可选择地，提供一种植物细胞中蛋白质互作的检测方法，其所采用的重组真核表达载体采用如前所述的重组真核表达载体的构建方法所构建。结果表明BirAG具有生物素化植物蛋白的能力，并能够生物素化与BirAG融合的目的蛋白相互作用的蛋白。以上结果表明所改造的BirAG具有筛选目的蛋白互作蛋白的能力。与现有技术相比较，本专利技术具有如下优势：(1)本专利技术的能在植物细胞中完整表达的改造的DH5αBirA基因及其构建方法，对野生的DH5αBirA基因或DH5αBirA*基因的剪切位点进行了改造，并对剪切位点附近的部分密码子进行优化，使之更符合真核生物中的表达模式，使改造后的BirAG基因可以在植物细胞中表达，并具有生物素化一系列植物细胞内源蛋白的能力。(2)本专利技术的能在植物细胞中完整表达的改造的BirAG基因及其构建方法，将所述改造后的BirAG基因与真核表达载体进行重组，可以在植物细胞中增强表达，能显著提高受体细胞生物素化蛋白数量，BirAG与目的蛋白融合后，可以生物素化与目的蛋白相互作用的蛋白。因此所改造的BirAG可以用于互作蛋白的筛选。附图说明图1为野生型DH5αBirA、DH5αBirA*突变体、改造的BirAG突变体的序列的比较。图2为p35S::DH5αBirA*和pUbi::DH5αBirA*瞬时转化水稻原生质体后RT-PCR扩增BirA*片段电泳图。图3为扩增出的两个条带分别测序的结果。图4为改造后的p35S::BirAG和pUbi::BirAG瞬时转化水稻原生质体后RT-PCR扩增BirAG片段电泳图。图5为p35S::BirAG::EGFP和pUbi::BirAG::EGFP瞬时转化水稻原生质体后激光共聚焦显微镜观察结果。图6为p35S::BirAG和pUbi::BirAG瞬时转化水稻原生质体后提取总蛋白，以HRP-Streptavidin为抗体的Western-blot结果图。图7为WT和pUbi::BirAG::OsFD2瞬时转化水稻原生质体后鉴定到的生物素化蛋白的比较。图8为pUbi::BirAG::OsFD2瞬时转化水稻原生质体后所鉴定到的蛋白与WT组进行比较，随机挑选出10个pUbi::BirAG::OsFD2组中鉴定到的特有的蛋白进行BiFC验证的结果。其中鉴定到的三个与OsFD2有互作的蛋白的BiFC结果图。具体实施方式以下结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细描述。(一)DH5αBirA*的获得。为构建DH5αBirA*，我们以大肠杆菌DH5α为材料进行PCR扩增，获得了DH5αBirA片段，并采用重叠延伸法构建DH5αBirA*突变体(突变了第352位碱基，C→G)，分别构建了两个载体，为p35S::DH5αBirA*、pUbi::DH5αBirA*。具体步骤如下：(1)从大肠杆菌中获得DH5αBirA片段DH5αBirA(SEQIDNo.2)的来源材料为大肠杆菌DH5α。通过PCR的方式，以BirAFw(上游引物，见SEQIDNo.3)和BirARe(下游引物，见SEQIDNo.4)为引物，直接将大肠杆菌菌落加入PCR体系中进行扩增，聚合酶BlendTaq由TOYOBO公司提供，具体PCR体系如下：所得产物与T载体相连接，连接所用缓冲液SolutionI由TAKARA公司提供，具体连接体系如下：将连接产物转化大肠杆菌，具体过程为5μl连接产物加入解冻的大肠杆菌JM109感受态中，冰浴30分钟，42℃热激90秒，立即冰浴5分钟以本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种能在植物细胞中完整表达的改造的DH5α BirA基因，其特征在于，所述改造的DH5α BirA基因与野生的DH5α BirA基因的差异在于编码第118位氨基酸的序列以及剪接识别位点的AG区域。

【技术特征摘要】
1.一种能在植物细胞中完整表达的改造的DH5αBirA基因，其特征在于，所述改造的DH5αBirA基因与野生的DH5αBirA基因的差异在于编码第118位氨基酸的序列以及剪接识别位点的AG区域。2.如权利要求1所述的能在植物细胞中完整表达的改造的DH5αBirA基因，其特征在于，所述改造的DH5αBirA基因能在水稻细胞中完整表达。3.如权利要求2所述的能在真核细胞中完整表达的改造的DH5αBirA基因，其特征在于，其序列为SEQIDNo.1所示。4.一种重组真核表达载体，其特征在于，其包含如权利要求1～3所述的改造的DH5αBirA基因。5.如权利要求4所述的重组真核表达载体，其特征在于，所述真核表达载体为pCAMBIA1390载体、pUbi载体或pUbi-EGFP载体。6.一种如权利要求4或5所述的重组真核表达载体的构建方法，其特征在于，其包括以下步骤：获得野生的DH5αBirA基因；对所述野生的DH5αBirA基因的可变剪接的剪切位点进行点突变，以获得能完整表达的改造的DH5αBirA基因。7.如权利要求6所述的重组真核表达载体的构建方法，其特征在于，对所述野生的DH5αBirA基因的可变剪接的剪切位点进行点突变之前，对所述野生的...

【专利技术属性】
技术研发人员：李洪清，林秋鹏，赵波，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：广东;44