【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于核酸检测，具体涉及一种基于crispr/cas12顺式切割的核酸检测方法、试纸条、试剂盒及应用。
技术介绍
1、近年来用于基因检测的核酸试纸条不断发展，该技术方法简单易操作，通过裸眼即可直接独处检测结果，广泛应用于现场快速核酸检测。核酸试纸条是在传统免疫检测试纸条的基础上发展起来的，其原理是基于三明治核酸杂交反应，结合纳米金粒子或其他纳米颗粒以及酶联免疫法等在侧向流动试纸条上实现比色检验。当前典型的核酸检测试纸条技术有通过带有两种不同标签的引物来进行pcr扩增或等温扩增，由此得到标签化的扩增产物，标签化的扩增产物可与试纸条上的亲和配体配合，从而在试纸条上被捕获。例如将单链dna或rna标签化并通过非对称pcr扩增或恒温扩增，与预先设计包埋在试纸条上的t线和c线探针特异性杂交并利用底物显色，达到检测效果。但现有的结合核酸扩增方法进行核酸检测的技术不具有光谱性，扩增效率差会导致检测效果不佳，并且扩增设计复杂，容易出现假阳性和特异性低的问题。
2、除此之外，还有基于crispr-cas系统的侧向流检测技术。crispr-cas系统包括cas蛋白和与cas9蛋白结合的向导rna，向导rna识别基因上的pam序列，cas蛋白在pam序列的特定位点进行切割，使dna断裂。目前基于crispr-cas系统的侧向流检测技术中，最为典型的是基于cas12a和cas13a的反式切割机制开发出来的detectr(dna endonuclease-targetedcrispr trans reporter)和sherlock(
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术中的缺点与不足，提供一种基于crispr/cas12顺式切割的核酸检测方法，通过cas蛋白/crrna复合体与目的序列的特异性切割反应，目的序列被crispr/cas12顺式切割之后产生掉落的待杂交粘性末端，并使待杂交粘性末端与信号探针结合，通过在检测位点上检测信号探针的信号，检测是否存在目的序列，提高检测的特异性和准确性。
2、本专利技术是通过以下技术方案实现的：
3、一种基于crispr的核酸检测方法，包括以下步骤：根据目的序列设计引物，并以待检测序列的基因组dna或rna为模板进行扩增，得到待检测序列的扩增片段序列；制备信号探针：信号探针包括标记探针及与标记探针连接的标记物，其中标记探针为核酸分子，标记探针的3’端为互补配对序列，所述互补配对序列用于与待杂交粘性末端互补配对，其中待杂交粘性末端为待检测序列的扩增片段序列被cas蛋白切割后掉落的带有粘性末端的pam远端序列片段；制备测试体系，并进行样品的检测：将cas蛋白和crrna混合形成cas蛋白/crrna复合体，将cas蛋白/crrna复合体与待检测序列的扩增片段序列混合；其中cas蛋白可顺式切割目的序列产生待杂交粘性末端；若待检测序列中存在目的序列，则cas蛋白/crrna复合体可与待检测序列的扩增片段序列发生特异性切割反应，并与待检测序列的扩增片段序列结合形成cas蛋白/crrna/待检测序列复合物，将cas蛋白/crrna/待检测序列复合物体系作为测试体系，其中，cas蛋白/crrna/待检测序列复合物体系包括cas蛋白/crrna/待检测序列复合物和待杂交粘性末端，待杂交粘性末端为待检测序列的扩增片段序列被cas12蛋白切割后掉落的带有粘性末端的pam远端序列片段；若待检测序列中不存在目的序列，则cas蛋白/crrna不与待检测序列的扩增片段序列发生反应，测试体系包括cas蛋白/crrna和未被切割的待检测序列的扩增片段序列；将测试体系与信号探针混合，若待检测序列中存在目的序列，则信号探针可与作为测试体系的cas蛋白/crrna/待检测序列复合物体系中的待杂交粘性末端结合；若待检测序列中不存在目的序列，则信号探针没有与测试体系发生反应；在检测载体中进行检测，检测载体上设有用于捕获待杂交粘性末端的检测位点，在所述检测位点上检测是否获取信号探针的信号，若检测到信号探针的信号，则待检测序列中含有目的序列，否则待检测序列中不含目的序列。
4、本专利技术提供一种基于crispr的核酸检测方法，cas蛋白/crrna复合体具有顺式切割活性，在制备测试体系的步骤中，cas蛋白/crrna复合体与待检测序列的扩增片段序列混合后，若待检测序列的扩增片段序列上存在目的序列，根据crispr-cas12蛋白的顺式切割活性，cas蛋白/crrna复合体搜索并识别待检测序列的扩增片段序列上的pam序列，crrna与目的序列的靶向区(pam位点后面的序列)互补配对，并在靶向区处进行切割，待检测序列的扩增片段序列被切割后掉落带有粘性末端的pam远端序列片段，即，cas蛋白/crrna复合体的顺式切割反应具有高度特异性，该待杂交粘性末端为靶标基因被cas蛋白/crrna复合体特异性识别并切割产生，由于信号探针中的标记探针具有与待杂交粘性末端互补的互补配对序列，信号探针与脱落的待杂交粘性末端结合。当进入检测载体中，待杂交粘性末端在检测载体的测试位点处被捕获，在捕获位置处可获取到信号探针的信号，从而测得待检测序列中含有目的序列。本专利技术通过cas蛋白/crrna复合体与目的序列的特异性切割反应产生待杂交粘性末端，并使待杂交粘性末端与与信号探针结合，通过在检测位点上检测信号探针的信号，从而检测是否存在目的序列，提高检测的特异性和准确性。
5、进一步，根据目的序列设计引物，并以待测物的基因组dna或rna为模板进行扩增，得到待检测序列的扩增片段序列的步骤中，引物带有修饰基团，修饰基团用于修饰于带有粘性末端的pam序列远端的一端，以待测物的基因组dna或rna为模板进行扩增，若待检测序列中存在目的序列，则得到带有修饰基团的待检测序列的扩增片段序列，其中修饰基因修饰于带有粘性末端的pam序列远端上；所述检测载体上包被有质控位点和至少一个检测位点，质控位点上包被有与标记探针结合的质控探针，检测位点上包被有用于与修饰基团结合的物质。在质控位点捕获标记探针以检验检测过程是否正常进行，检测位点处包被有与修饰基团结合的物质，以捕获修饰有修饰基团的带有粘性末端的pam远端序列片段，即，捕获待杂交粘性末端，从而在该处显示出信号探针的信号。
6、进一步，所述检测载体为试纸条、微阵列芯片、石墨烯芯片、微流控芯片、荧光检测仪中的至少一种，所述标记探针的中段与质控位点上的质控探针互补配对。设计标记探针时，为避免干扰标记探针与粘性末端片段的配对，需要避免将标记探针的两端设计为与质控位点结合的位点，因此设计标记探针的中段与质控位点结合。本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于CRISPR/Cas蛋白的核酸检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas蛋白的核酸检测方法，其特征在于：
3.根据权利要求2所述的基于CRISPR的核酸检测方法，其特征在于：
4.根据权利要求3所述的基于CRISPR/Cas蛋白的核酸检测方法，其特征在于：
5.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas蛋白的核酸检测方法，其特征在于：
6.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas蛋白的核酸检测方法，其特征在于：
7.一种基因检测试纸条，其特征在于：
8.根据权利要求7所述的基因检测试纸条，其特征在于：
9.一种基因检测试剂盒，其特征在于：
10.权利要求9所述的基因检测试剂盒在基因检测中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种基于crispr/cas蛋白的核酸检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的基于crispr/cas蛋白的核酸检测方法，其特征在于：
3.根据权利要求2所述的基于crispr的核酸检测方法，其特征在于：
4.根据权利要求3所述的基于crispr/cas蛋白的核酸检测方法，其特征在于：
5.根据权利要求1所述的...
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