可利霉素生物合成基因簇制造技术

本发明专利技术提供了可利霉素生物合成连锁基因簇，共有44个基因开放阅读框，核苷酸序列全长89315 bp，其中含有5个编码聚酮合酶，包括8个模块，37个结构域，以及与聚酮合成延长单位及修饰相关的orf有9个，与糖基合成相关的orf有16个，与糖基转移相关的orf有6个。通过基因簇序列信息和结构分析，可以进一步对其产生菌进行遗传操作，获得新型、更有效的抗生素，如通过基因操作来改变其PKS合成模块式结构、进行内酯环后修饰的改变、糖基因的置换或修饰，创造新的大环内酯类抗生素，也可以通过对抗性基因或调节基因的遗传操作，提高抗生素的产量本发明专利技术所提供的氨基酸序列，可以用来分离需要的蛋白质并可用于抗体制备。

【技术实现步骤摘要】

：本专利技术属于微生物基因资源和基因工程领域，具体涉及基因工程抗生素生物合成基因簇的克隆、分析、功能研究及其应用。技术背景：可利霉素曾用名生技霉素、必特螺旋霉素，是利用合成生物学技术研制的16元环大环内酯类抗生素[专利号：ZL971044406、ZL021487715]，是以4”-异戊酰螺旋霉素Ⅲ、Ⅱ、Ⅰ为主组分的在4”-位羟基多种酰基化的螺旋霉素，其中Ⅲ组分约占30％以上、Ⅱ组分25％左右，Ⅰ组分不超过10％。可利霉素结构式异戊酰螺旋霉素Ⅲ：R＝COCH2CH3R′＝COCH2CH(CH3)2异戊酰螺旋霉素Ⅱ：R＝COCH3R′＝COCH2CH(CH3)2异戊酰螺旋霉素Ⅰ：R＝HR′＝COCH2CH(CH3)2可利霉素对革兰氏阳性菌有较强的活性，对红霉素和β-内酰胺类抗生素耐药菌、流感杆菌、淋球菌、军团菌、脆弱拟杆菌、产气荚膜梭菌有抗菌活性。尤其对肺炎支原体、沙眼衣原体和肺炎衣原体具有较强的活性[余兰香等，四川生理科学杂志；1998,20(3),专利号：2003101224209]，有较好的抗生素后效应和抗生素亚抑菌浓度效应。其与同类药没有完全交叉耐药性。药代动力学研究表明，可利霉素有较高的亲脂性，在胞内抗菌活性强，口服吸收快，绝对生物利用度高，组织渗透性强，其组织浓度高于血浆浓度，组织分布广，消除半衰期长，在体内维持时间长[孙丽文等，中国药理学通报2000，16(6)：694-8；钟大放等，JchromatographyB.2003，791：45；史向国等，AsianJournalofDrugMetabolismandPharmacokinetics.2003，3(2)：134；史向国等，ChineseChemicalletter2004,15:431；史向国等，ActaPharmacologicaSinica,2004,25:1396]。药理、毒理及已完成的临床三期研究结果表明，可利霉素用于治疗呼吸道感染其疗效确切，不良反应率低，尤其对肝脏损害小，安全性好[林赴田等，第八次全国抗生素学术会议论文汇编1997,p.167；赵春燕等，中国抗生素杂志1998,23(4)：306；孙涛等，中国抗生素杂志2001，26(1)：49-51]。可利霉素是利用基因重组技术获得的基因工程菌发酵直接产物，制备工艺简便、可以有效地避免化学污染及节省能源。其口服制剂服用方便，每日只需服用一次，有利于提高患者的用药依从性，也便于进入基本医保药物系列。可利霉素是利用基因重组技术，将碳霉素产生菌4”-异戊酰基转移酶基因在螺旋霉素产生菌(StreptomycesspiramyceticusF21)中进行克隆表达，获得基因工程菌(StreptomycesspiramyceticusWSJ-1)的发酵产物。所述螺旋霉素产生菌(StreptomycesspiramyceticusF21)，是本实验室于1982年从中国甘肃永昌县土壤中分离得到的，该菌的形态培养特征、生理生化特征、细胞壁化学组成以及16SrRNA基因序列和5个看家基因蛋白水平在系统发育树分析中的地位，与国外报道的螺旋霉素产生菌StreptomycesambofaciensATCC23877和已报道的链霉菌均无共同之处，故极可能为一株链霉菌新种[戴剑漉等，微生物学通报2012，39(4)：503-514]。螺旋霉素产生菌StreptomycesambofaciensATCC23877中与螺旋霉素生物合成相关基因簇测序已经完成[KarrayF.Microbiology2007,153:4111-4122]，其他大环内酯类抗生素如阿维菌素、刀豆霉素、红霉素、查耳霉素、泰洛菌素和麦迪霉素生物合成基因簇序列也已有报道[IkedaH.etalNat.Biotechnol.2003,21(5):526-531、HaydocketalMicrobiology2005,151,3161-3169；OliynykM.etalNat.Biotechnol.2007,25(4):447-453；WardsL.etalAntimicrob.Agents&Chemotherapy2004,48(12):4703-4712；CundiffeE.etalAntonieVanLeeuwenhoek2001,79(3-4):229-234；MidohNaokietalUSpatent7070980]。大环内酯类抗生素生物合成基因簇全长约50-80kb，其共同特征是，由编码16元大环内酯环生物合成模块式结构的聚酮合酶(PKS)、聚酮合成延长单位相关酶、负责内酯环不同基团修饰的酶、糖基合成和转移相关酶的基因以及与抗性和调控功能相关基因等组成。大环内酯是由模块结构形式组成的PKS催化，以类似脂肪酸生物合成的方式，通过连续缩合反应将一些简单的羧酸分子催化形成的。每一个模块在聚酮链形成过程中只负责一步缩合反应，它至少包含一个β-酮酯酰合成酶(KS)结构域，一个酰基转移酶(AT)结构域和一个酰基载体蛋白(ACP)结构域。此外，它还可能包含一个β-酮酯酰还原酶(KR)结构域，一个脱水酶(DH)结构域和一个酯酰还原酶(ER)结构域，它们决定了加入延伸单位的还原步骤。同时，还需要硫酯酶(TE)结构域的作用，以催化聚酮链的环化与释放。最后，还要经过羟基化、甲基化、甲氧基化和酰基化等修饰步骤，形成多种多样的大环内酯类抗生素的结构。通常大环内酯均与不同数量的糖基(或糖胺基)相连，如可利霉素含有三个糖基，分别是福洛糖胺、碳霉糖胺和碳霉糖。它们是由糖基合成和转移相关酶负责。抗性基因赋予产生菌拮抗自身产生抗生素的能力，通常与ABC转运蛋白相关。调控功能相关的基因参与自身生物合成抗生素的调控。通过基因簇序列信息和结构分析，可以进一步对其产生菌进行遗传操作，获得新型、更有效的抗生素，如通过基因操作来改变其PKS合成模块式结构、进行内酯环后修饰的改变、糖基因的置换或修饰，创造新的大环内酯类抗生素；也可以通过对抗性基因或调节基因的遗传操作，提高抗生素的产量。[WilkinsonB.etalChemBiol2000,7(2):111-117；KalzL.etalMedResRev1999,19(6):543-58；GoodmanCDetalAntimicrobialAgentsandChemotherapy,2013,57(2):907–913；WangWetalProcNatlAcadSciUSA2014,111(15)：5688-93；StratigopoulosGetalMolMicrobiol.2004,54(5)：1326-34本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可利霉素生物合成基因簇，其特征是，所述生物合成基因簇共有44个基因，具体为：1)聚酮合酶基因orf10‑14，共5个基因；2)与聚酮合成延长单位及修饰相关的基因orf1、orf4‑6、15、36‑39，共有9个基因；3)与糖基合成相关基因orf9、16‑22、24、26、28、29、33‑35、41，共16个基因；4)与糖基转移相关基因orf7、8、30‑32、40，共6个基因；5)与抗性相关基因orf3和25，共2个基因；6)与生物合成调控相关基因orf 2、23、27、42，共4个基因；7)外源引入的基因工程菌标记基因orf43和与之连锁的碳霉糖4”O‑羟基异戊酰转移酶基因orf44，共2个基因。

【技术特征摘要】
1.一种可利霉素生物合成基因簇，其特征是，所述生物合成基因簇共有44个基因，具体
为：
1)聚酮合酶基因orf10-14，共5个基因；
2)与聚酮合成延长单位及修饰相关的基因orf1、orf4-6、15、36-39，共有9个基因；
3)与糖基合成相关基因orf9、16-22、24、26、28、29、33-35、41，共16个基因；
4)与糖基转移相关基因orf7、8、30-32、40，共6个基因；
5)与抗性相关基因orf3和25，共2个基因；
6)与生物合成调控相关基因orf2、23、27、42，共4个基因；
7)外源引入的基因工程菌标记基因orf43和与之连锁的碳霉糖4”O-羟基异戊酰转移酶
基因orf44，共2个基因。
2.如权利要求1所述生物合成基因簇，其特征是，所述的5个聚酮合酶基因编码催化可
利霉素16元内酯环聚酮体生物合成酶，即orf10-14的核苷酸序列或互补序列及其相应的氨
基酸序列，即IA-W10、IA-W11、IA-W12、IA-W13和IA-W14。
3.如权利要求1或2所述的生物合成基因簇，其特征是，5个聚酮合酶包含模块或结构
域，即酮基合成酶(KS)、酰基转移酶(AT)、酮基还原酶(KR)、脱水酶(DH)、烯酰基还原酶
(ER)、酰基载体蛋白(ACP)、硫酯酶结构域的核苷酸序列或互补序列及其相应的氨基酸序
列。
4.如权利要求1所述的生物合成基因簇，其特征是，所述聚酮合成延长单位及修饰相关
基因orf1、orf4-6、15、36-39的核苷酸序列或互补序列及...

【专利技术属性】
技术研发人员：王以光，姜洋，赵小峰，赫卫清，戴剑漉，
申请(专利权)人：沈阳同联集团有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁;21