本发明专利技术涉及表征急性毒性的重组质粒、重组菌及其构建方法与应用。具体而言，重组质粒含有卡那霉素抗性基因片段与报道基因片段，所述报道基因为发光基因，报道基因片段具有独立的启动子，所述的启动子为组成型表达，重组质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。表征急性毒性的重组菌，由表征急性毒性的重组质粒转化导入不动杆菌Acinetobacter baylyi ADP1中获得，其命名为Acinetobacter baylyi HesenATox，已于2016年10月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13117。当重组菌暴露于具有生物毒性的环境中，细胞发光受到抑制，报道基因表达量降低，发光值与毒性剂量成反向效应关系，因此可用于评价环境样品的急性毒性。与现有技术相比，本发明专利技术重组菌性能更为稳定。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物技术，尤其是涉及一种表征急性毒性的重组质粒、重组菌及其构建方法与应用。
技术介绍
随着工业化的发展以及农业领域中化学物的大量使用等，环境体系中，包括水体，大气及土壤等，储存了越来越多的有毒有害物质，造成了一系列的问题。(Jaffrezic-Renault,N.,Dzyadevych,S.V.,2008.Conductometricmicrobiosensorsforenvironmentalmonitoring.Sensors8:2569-2588)。当生命体暴露在这种环境里，他们的生长、繁殖以及物种变迁等均被这些有毒有害物质影响，从而造成疾病的发生。这其中不乏具有急性毒性的物质，人类或动物一次或短时间接触后即会引起中毒甚至死亡。因此，对于环境样品的毒性监测与检测成为了关乎生态系统安全和生命安全的重要问题。目前常规的环境毒性物质检测主要采用化学分析方法进行，包括气相色谱法、高效液相色谱法、原子吸收光谱法等。虽然这些化学方法可以提供高灵敏度和精度，但他们也面临着预处理方法繁琐、仪器成本较高且无法在现场进行、仪器复杂需专业培训人员操作、耗时耗力等缺点。更重要的是，这些结果只能显示环境样品物质成分，但无法给出综合毒性评价，更无法体现该物质在环境中的生物有效性，忽略了毒性物质间的拮抗、加合和协同作用(Sorensen,S.J.,M.Burmolle,andL.H.Hansen,Makingbio-senseoftoxicity:newdevelopmentsinwhole-cellbiosensors.CurrentOpinioninBiotechnology,2006.17(1):11-16)。因此，生物监测手段在评估环境样品对于生命体的危害性领域具有更重要的意义。其中，生物传感器检测方法具有快速、简单、高特异性和灵敏度且经济有效等优点，虽不能给出所有成分的具体浓度，但可以提供样品对于目标生物的综合毒性，近年来发展迅速。传统发光菌是一类在自然界中分离的能够产生化学发光现象的微生物。当细胞受急性毒物影响时，发光强度下降。Bulich等(Bulich,A.A.,HartmanP.A..Evaluationofthalliumacetate-citratemediumforisolationofenterococci.AppliedMicrobiology,1969,18(5):944-945)最早提出水环境毒性检测的发光细菌法，而明亮发光杆菌也已作为国家标准方法用于水质急性毒性测定(GB/T15441-1995,水质急性毒性的测定发光细菌法)。基于生物传感器的急性毒性生物传感器原理为当启动基因为组成型表达时，毒性物质会抑制报道基因的转录和翻译，从而导致报道基因产物量(通常为发光强度)减少，因此通过检测报道基因强度即可表征毒性强度。该方法响应快速，操作简单，成本较低，是较为可靠的急性毒性快速检测手段。目前已报道的急性毒性检测的传感细胞宿主主要为不动杆菌(唐慧,宋一之,姜博,陈光玉,贾建丽,张旭,李广贺.生物传感细胞ADP1_pWHlux在水环境急性毒性检测中的应用,环境科学,2015,36:3872-3877)等，并被应用于环境样品。该细胞为通过不动杆菌AcinetobacterbaylyiADP1转化pWHlux得到，其中pWHlux在pWH274质粒基础上插入发光基因片段luxCDABE构建得到。菌株生长及测试时采用含有200μg/mL氨苄西林(amp)的Luria-Bertani(LB)培养基。但因ADP1本身含有一个编码β-内酰胺酶的基因ampC，因此可以一定程度上抵抗β-内酰胺类抗生素，而氨苄西林本身即为β-内酰胺类抗生素的一种。因此在使用氨苄西林对细胞进行培养时，容易出现质粒表达不稳定或丢失的情况，从而导致细胞发光值的下降，影响毒性分析的准确度。因此，构建稳定表达的新型急性毒性菌株对于提高环境样品毒性分析的准确度与可靠性具有至关重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种表征急性毒性的重组菌及其构建方法与应用。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：一种表征急性毒性的重组质粒，记为pWHKm_lux，所述的重组质粒含有卡那霉素抗性基因片段与报道基因片段，所述的报道基因片段具有独立的启动子，所述的启动子为组成型表达，当细胞暴露在毒性环境中，细胞活性受到抑制，报道基因表达量降低，因此通过检测报道基因强度即可表征毒性强度。所述的重组质粒的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。所述卡那霉素抗性基因片段从5'到3'方向的核苷酸序列为SEQIDNO.1自5'末端第11179-12287位核苷酸片段。所述的报道基因可为发光基因luxCDABE，所述luxCDABE基因从5'到3'方向的核苷酸序列为SEQIDNO.1自5'末端第384-6181位核苷酸片段。所述luxCDABE基因使用原质粒的Ptet启动子，为组成型表达。所述的表征急性毒性的重组质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)卡那霉素抗性基因片段的获得：以pRMJ1质粒为模板，PCR获得卡那霉素抗性基因，两个引物所设置的酶切位点与质粒pWH1274的AhdI和AatII相匹配，PCR反应后进行纯化，将纯化的PCR产物用限制性内切酶AhdI和AatII进行双酶切，获得卡那霉素抗性基因片段；2)含有卡那霉素抗性基因的重组表达载体pWHkm的获得：用限制性内切酶AhdI和AatII酶切质粒pWH1274，用T4DNA连接酶将卡那霉素抗性基因片段与酶切的质粒pWH1274片段连接，卡那霉素抗性基因通过AhdI和AatII双酶切位点替换质粒pWH274中的氨苄西林抗性基因，获得含有卡那霉素抗性基因的重组表达载体pWHkm，将其转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基筛选得到重组表达载体pWHkm；3)报道基因片段的获得：以pSalAR_lux质粒为模板，PCR获得报道基因luxCDABE片段，两个引物所设置的酶切位点为质粒pWH1274的BamHI，PCR反应后进行纯化，将纯化的PCR产物用限制性内切酶BamHI进行酶切，获得报道基因luxCDABE片段；4)含有报道基因能够表征急性毒性的重组质粒pWHKm-lux的构建：用限制性内切酶BamHI来酶切步骤2)所得重组表达载体pWHkm，用T4DNA连接酶将报道基因片段与酶切的重组表达载体pWHkm片段连接，获得含有报道基因能够表征急性毒性的重组质粒pWHKm-lux，重组质粒pWHKm-lux转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基上筛选发光的菌落，提取质粒即为表征急性毒性的重组质粒。上述构建表征急性毒性的重组质粒的方法给出了本领域常用的一种方法，也可以采用其他的生物操作方法。一种表征急性毒性的重组菌，由表征急性毒性的重组质粒转化导入不动杆菌(Acinetobactersp.)AcinetobacterbaylyiADP1中获得。所述的重组菌命名为AcinetobacterbaylyiHesenATox，已于2016年10月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种表征急性毒性的重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒含有卡那霉素抗性基因片段与报道基因片段，所述的报道基因片段具有独立的启动子，所述的启动子为组成型表达。
【技术特征摘要】
1.一种表征急性毒性的重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒含有卡那霉素抗性基因片段与报道基因片段，所述的报道基因片段具有独立的启动子，所述的启动子为组成型表达。2.根据权利要求1所述的一种表征急性毒性的重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。3.根据权利要求1所述的一种表征急性毒性的重组质粒，其特征在于，所述卡那霉素抗性基因片段的核苷酸序列为SEQIDNO.1自5'末端第11179-12287位核苷酸片段。4.根据权利要求1所述的一种表征急性毒性的重组质粒，其特征在于，所述的报道基因为发光基因luxCDABE，所述luxCDABE基因的核苷酸序列为SEQIDNO.1自5'末端第384-6181位核苷酸片段。5.一种如权利要求1-4中任一项所述的表征急性毒性的重组质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)卡那霉素抗性基因片段的获得：以pRMJ1质粒为模板，PCR获得卡那霉素抗性基因，两个引物所设置的酶切位点与质粒pWH1274的AhdI和AatII相匹配，PCR反应后进行纯化，将纯化的PCR产物用限制性内切酶AhdI和AatII进行双酶切，获得卡那霉素抗性基因片段；2)含有卡那霉素抗性基因的重组表达载体pWHkm的获得：用限制性内切酶AhdI和AatII酶切质粒pWH1274，用T4DNA连接酶将卡那霉素抗性基因片段与酶切的质粒pWH1274片段连接，获得含有卡那霉素抗性基因的重组表达载体pWHkm，将其转化入感受态细胞，通过含有卡那霉素的LB培养基筛选得到重组表达载体pWHkm；3)报道基因片段的...
【专利技术属性】
技术研发人员：王允，罗艳君，
申请(专利权)人：上海合森生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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