一种高效的植物双元诱导基因表达重组质粒制造技术

一种高效的植物双元诱导基因表达重组质粒，由以下步骤实现：构建受生长素IAA诱导的DR5启动子，以此启动子启动酵母转录激活蛋白Gal4的BD结构域表达；构建受低温诱导的启动子，以此启动子启动酵母转录激活蛋白Gal4的AD结构域表达；构建受Gal4激活的启动子，以此启动报告基因GFP的表达；将上述三个表达段导入同一个植物表达载体pBI121，即可。本发明专利技术需要两个诱导条件同时存在时才能诱导报告基因表达，减少干扰；同时，本发明专利技术利用Gal4/UAS系统基本原理，实现了诱导信号的两级放大，可以提高诱导信号的检测灵敏度；另外，本发明专利技术还具有很大的灵活性和延伸性，多种响应化学信号、物理信号的DNA元件都可以用于构建双元诱导表达系统，可以广泛应用于现代遗传学和分子生物学的研究。

An efficient recombinant plasmid for binary gene expression induced by plants

An efficient binary plant gene expression induced by recombinant plasmid, is achieved by the following steps: constructing the auxin induced IAA DR5 promoter, BD promoter in order to start the domain of the yeast transcriptional activator protein Gal4 expression induced by low temperature; construction of promoter, in order to start the AD domain and the yeast transcriptional activator protein Gal4 the construction of Gal4 expression; activates the promoter to initiate the expression of reporter gene GFP; the three section of the same expression into the plant expression vector pBI121. The present invention requires two induction conditions existing at the same time can induce gene expression, reduce interference; at the same time, the invention uses the basic principle of Gal4/UAS system, realizes two level amplification induced signal, the detection sensitivity can be improved by signal; in addition, the invention also has great flexibility and extensibility, a variety of chemical components in response to DNA the signal, the physical signal can be used to construct the dual expression system, the research can be widely used in modern genetics and molecular biology.

【技术实现步骤摘要】
一种高效的植物双元诱导基因表达重组质粒
本专利技术属于基因工程
，涉及一种利用两个诱导条件控制基因在植物中表达的质粒，即一种高效的植物双元诱导基因表达质粒，是一种遗传学和分子生物学研究有力工具。
技术介绍
受生长素特异性诱导的启动子响应元件有D1、P3、ER7和DR5等，其中，由基本序列TGTCTC以一定间隔多次重复而成的DR5是生物活性最强的响应元件之一，近年来，通过与报告基因融合，DR5等高活性生长素特异性诱导启动子被广泛应用于研究IAA相关突变体的遗传筛选、植物组织和细胞对IAA的响应以及IAA诱导基因的表达与定位。植物中还普遍存在感受温度条件的保守反应元件，如拟南芥RD29A基因启动子中的DRE元件(核心序列为CRT)可以控制基因在低温下的激活表达。其他一些冷诱导型基因启动子中也存在多个CRT重复，如拟南芥COR15A、油菜BN115和小麦WCS120等。Gal4为酵母转录激活蛋白基因，其编码蛋白能识别目标基因启动子上游激活序列(UAS)中17bp的片段(5'-CGGN11CCG-3')。Gal4具有两个结构域：DNA结合结构域(BD)和转录激活结构域(AD)，其编码序列可以分别用两个启动子启动表达，然后在胞内自主装成完整的Gal4，通过结合UAS以激活下游基因的表达。因而，Gal4/UAS系统是一个模式生物中被广泛应用的基因表达及功能研究工具。尽管诱导启动子及基因诱导表达系统已经广泛用于遗传学和分子生物学研究中，但这些系统都是单因素诱导型(即由单一条件诱导基因表达)，在某些特殊领域，由于生物体自身的背景物质的干扰而造成诱导时间和诱导程度并不同步。另外，现有的诱导表达系统大多是单级的，在诱导信号放大方面有一定的应用局限性，因此设计一种双元的具有两级放大作用的基因诱导表达系统具有很好的应用前景。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，克服现有基因诱导表达系统的不足，提供一种高效的植物双元诱导基因表达重组质粒，其需要两个诱导条件同时存在时才能诱导报告基因表达，可以保证取样植物材料免受背景(如IAA)干扰与实现诱导时间和诱导程度的同步化；同时，本专利技术利用Gal4/UAS系统基本原理，实现了诱导信号的两级放大，可以提高诱导信号的检测灵敏度。为解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案是：一种高效的植物双元诱导基因表达重组质粒，该重组质粒是将DR5Pro::BDGal4表达段、LTPro::ADGal4表达段及UASPro::GFP表达段同时导入同一植物表达载体pBI121中得到；其中，上述DR5Pro::BDGal4表达段是通过构建受生长素IAA诱导的启动子DR5Pro，以此启动子启动酵母转录激活蛋白Gal4的BD结构域表达得到；上述LTPro::ADGal4表达段是构建受低温诱导的启动子，以此启动子启动酵母转录激活蛋白Gal4的AD结构域表达得到；上述UASPro::GFP表达段是通过构建受Gal4激活的启动子上游激活序列UAS，以此启动报告基因GFP的表达得到。较具体地，上述DR5Pro::BDGal4表达段是通过人工合成含7个重复的受生长素诱导的DR5响应元件，在其后接上CaMV35S启动子的最小启动元件组成生长素诱导启动子DR5Pro，然后在DR5Pro后添加酵母转录激活蛋白Gal4的BD结构域基因及Nos终止子融合得到。上述LTPro::ADGal4表达段是在LTPro低温诱导启动子后融合酵母转录激活蛋白Gal4的AD结构域编码序列和Nos终止子得到；其中，该LTPro低温诱导启动子(为英文lowtemperaturepromoter的缩写)包括：一是通过人工合成7个重复的受低温诱导的DRE元件，在其后接上CaMV35S启动子的最小启动元件组成DRE启动子；二是直接克隆拟南芥中的COR15A、油菜中BN115和小麦中的WCS120低温诱导启动子。上述UASPro::GFP表达段是通过克隆受Gal4激活的启动子上游激活序列UAS，在其后接上CaMV35S启动子的最小启动元件组成UASPro，然后在UASPro后添加报告基因GFP及Nos终止子融合得到。检测原理：Gal4为酵母转录激活蛋白，包括DNA结合结构域(BD)和转录激活结构域(AD)，完整的Gal4能识别目标基因启动子上游激活序列(UAS)激活下游基因的表达。前人的研究已经证明，当分别表达Gal4的AD和BD结构域时，如果AD和BD能够互相靠近并组装成复合体，那么这种复合体同样可以行使Gal4的功能，从而与UAS结合并激活下游基因表达。本专利技术构建两种诱导启动子(受生长素诱导的DR5Pro和受低温诱导的LTPro)分别启动Gal4的BD和AD结构域的表达，当生长素和低温同时存在时，BD和AD被诱导表达后可组装成复合体，从而结合UAS并激活报告基因GFP的高效表达。为了保证BD和AD能高效组装，本专利技术在BD的碳端和AD的氮端融合了互相咬合的亮氨酸拉链结构。本专利技术效果是：本专利技术需要两个诱导条件同时存在时才能诱导报告基因表达，可以排除干扰因素，确保目的基因按预期准确表达；同时，本专利技术利用Gal4/UAS系统基本原理，实现了诱导信号的两级放大，可以提高诱导信号的检测灵敏度；另外，本专利技术还具有很大的灵活性和延伸性，多种响应化学信号、物理信号的DNA元件均可以用于构建双元诱导表达系统，可以广泛应用于现代遗传学和分子生物学的研究。附图说明图1是是本专利技术的双元诱导基因表达系统原理图。图2是pBI121质粒图谱。图3是转基因拟南芥根中GFP在不同处理时间下的诱导表达图。其中，每个时间点包含二个图，左图为荧光图，右图为明场图。图4是转基因拟南芥原生质体细胞中GFP在不同处理时间下的诱导表达图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步描述。一、材料、试剂与仪器植物材料：哥伦比亚野生型拟南芥(ArabidopsisthalianaL.)种子由本实验室保存和扩繁。菌株和质粒：克隆用大肠杆菌(Escherichiacoli)菌株DH5α、根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株GV3101、相关质粒均在本实验室扩繁和保存。其中植物表达载体pBI121作为重组载体基础骨架；pEGAD载体作为增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP)基因供体；pGAT7AD作为GAL4AD和核定位信号序列(nuclearlocalizationsequence，NLS)的供体；pGBKT7作为GAL4BD供体；pCambia1301作为Nos终止子(Nosterminator)的供体；pYES2作为UAS元件的供体。主要试剂与耗材：RNA抽提试剂、逆转录酶、DNA聚合酶、T载体和Real-TimePCR试剂盒购于北京全式金生物技术有限公司；DNA内切酶购于Takara和ThermoFisher公司；纤维素酶、崩溃酶及纯度要求较高的试剂购于Sigma公司；其它常规试剂购于生工生物工程(上海)股份有限公司；小立碗藓用培养瓶/皿、细胞分选用离心管和激光共聚焦显微镜专用培养皿等关键耗材购于Corning公司。主要仪器设备：Nuaire超低温冰箱、BarnsteadD3750超纯水系统、Beckman超速本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高效的植物双元诱导基因表达重组质粒，其特征在于，该重组质粒是将DR5Pro::BD

【技术特征摘要】
1.一种高效的植物双元诱导基因表达重组质粒，其特征在于，该重组质粒是将DR5Pro::BDGal4表达段、LTPro::ADGal4表达段及UASPro::GFP表达段同时导入同一植物表达载体pBI121中得到；其中，上述DR5Pro::BDGal4表达段是通过构建受生长素IAA诱导的启动子DR5Pro，以此启动子启动酵母转录激活蛋白Gal4的BD结构域表达得到；上述LTPro::ADGal4表达段是构建受低温诱导的启动子LTPro，以此启动子启动酵母转录激活蛋白Gal4的AD结构域表达得到；上述UASPro::GFP表达段是通过构建受Gal4激活的启动子上游激活序列UAS，以此启动报告基因GFP的表达得到。2.根据权利要求1所述的一种高效的植物双元诱导基因表达重组质粒，其特征在于，所述DR5Pro::BDGal4表达段是通过人工合成含7个重复的受生长素诱导的DR5响应元件，在其后接上CaMV35S启动子的最小启动元件组成生...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖浪涛，苏益，黄志刚，蔺万煌，王若仲，罗为桂，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43