一种实时监测沼气发酵体系的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种实时监测沼气发酵体系的方法及应用，属于沼气发酵技术领域。本发明专利技术所提供的方法是通过扩增gfp基因、将其连接转化入宿主微生物中、筛选阳性克隆构建GFP基因标记的工程菌，然后将GFP基因标记的工程菌用于沼气发酵体系中，实时监测发酵系统。本发明专利技术方法克服了厌氧发酵过程中微生物生物量及代谢活性在空间和时间的分布难以实时监测的问题，将GFP基因标记的工程菌应用于沼气发酵系统的监测，能够实现快速、准确监测发酵状态及检测发酵体系中的目标微生物，定量追踪微生物数量，及时发现发酵过程中的不稳定因素，从而进一步优化产气。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种实时监测沼气发酵体系的方法及应用，属于沼气发酵

技术介绍
随着化石能源危机不断加剧，环境问题日益突出，可再生清洁能源受到越老越多的关注。而沼气发酵由于其能量产出/投入比(28:1)高，可利用底物广泛，产物清洁，具有突出的优势。目前，中国运营了上万个大中型沼气工程，但普遍存在处理效率低和运行稳定性差等问题。沼气工程是一个生物化学过程，对微生物的监测和控制至关重要。由于微生物的适应性及发酵条件的多因素互相影响，厌氧发酵过程通常在产气量下降之前很难发现问题。发酵体系对有机负荷、抑制物浓度等条件的变化十分敏感，而一旦出现发酵失败，发酵菌群失衡，活性污泥分解破坏，发酵较难恢复。这对生产、经济造成极大影响。利用复杂有机物产生甲烷，需要大量的微生物参与。根据其代谢特性，可以分为产甲烷微生物和非产甲烷微生物两类。具体地，根据厌氧发酵4阶段理论，可以分水解微生物、产酸产氢微生物、产乙酸微生物和产甲烷微生物4类。这些微生物进行一系列的生物化学偶联反应，存在物质、能量上的相互依赖，又互相制约的关系，整个代谢过程极为复杂。因此，对于微生物发酵情况的监测也很难进行。常用的监测方法为FISH技术、RealTimeQuantityPCR、DGGE/TGGE、16SrRNA序列比较法、T-RFLP法、宏基因组测序等。这些方法具有检测周期长、耗费大、不能准确反映细胞生物量等缺点。绿色荧光蛋白(GreenFluorescentProtein，GFP)是由238个氨基酸组成的蛋白，最初是由Shimomure从多管水母中提取出来的。野生的GFP具有395nm的最大吸收峰和510nm的最大发射峰。GFP作为分子标记物，其荧光性质特殊，具有诸多优点而备受关注。首先，GFP易于检测，灵敏度高，其荧光反应不需要外加底物和辅助因子。其次，载体构建方便，且对细胞无毒害，因此可以直接用于活细胞测定。再次，GFP的表达几乎不受种属范围的限制，在微生物、动物、植物中都获得成功表达。因此，本专利技术将GFP基因标记的工程菌应用于沼气发酵系统的监测，能够实现快速、准确的对发酵体系中目标微生物的监测，及时发现发酵过程中的不稳定因素，从而进一步优化产气。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对厌氧发酵过程中微生物生物量及代谢活性在空间和时间的分布难以实时监测的问题，采用GFP标记的方法，能够实现快速检测发酵状态的监测，定量追踪微生物数量。本专利技术提供了一种实时监测沼气发酵体系的方法，采用的技术方案如下：本专利技术的目的在于提供一种实时监测沼气发酵体系的方法，该方法是通过扩增gfp基因、将其连接转化入宿主微生物中、筛选阳性克隆构建GFP基因标记的工程菌，然后将GFP基因标记的工程菌用于沼气发酵体系中，实时监测发酵系统。优选地，所述宿主微生物，为发酵体系本源微生物或者外源添加微生物。优选地，所述宿主微生物，含有原核表达载体pET15b-gfp。优选地，所述方法，步骤如下：1)通过PCR扩增gfp基因序列，获得扩增产物；2)将步骤1)获得的扩增产物连接到pET15b载体上，构建获得重组子pET15b-gfp；3)将步骤2)获得的重组子pET15b-gfp转入宿主微生物细胞中，培养后筛选阳性克隆，获得GFP基因标记的工程菌；所述宿主微生物为发酵体系本源微生物或者外源添加微生物；4)将步骤3)获得的GFP基因标记的工程菌添加到沼气发酵体系中，通过测定荧光值实时监测发酵系统。优选地，步骤1)所述PCR扩增所利用的引物含有BamHI酶切位点。优选地，步骤3)所述宿主微生物，包括参与沼气代谢过程的水解型微生物、产酸产氢微生物、产乙酸微生物或产甲烷微生物。优选地，步骤3)所述转入，方式为电转化。优选地，步骤3)所述培养，是在厌氧条件下培养。更优选地，所述的方法，其特征在于，具体步骤如下：1)通过PCR扩增gfp基因序列，获得扩增产物；所述PCR扩增所利用的引物含有BamHI酶切位点；2)利用BamHI酶对pET15b质粒进行酶切处理，利用DNA连接酶将步骤1)获得的扩增产物连接到pET15b载体上，构建获得重组子pET15b-gfp；3)将步骤2)获得的重组子pET15b-gfp通过电转化转入宿主微生物细胞中，厌氧条件下进行培养；所述宿主微生物含有原核表达载体pET15b-gfp；所述宿主微生物为发酵体系本源微生物或者外源添加微生物，包括参与沼气代谢过程的水解型微生物、产酸产氢微生物、产乙酸微生物或产甲烷微生物；4)在荧光显微镜下挑选具有荧光的单克隆，获得GFP基因标记的工程菌；5)将步骤4)获得的GFP基因标记的工程菌添加至沼气发酵体系中，通过定时定点取样、测定荧光值，实时监测目标微生物在体系中的时间和空间分布，以及在有机负荷或有害物质冲击下微生物的活性。以上所述任一方法在实施监测厌氧发酵体系、沼气发酵体系、追踪目标微生物、监测微生物空间和时间分布，以及监测在外界冲击下生物量变化中的应用。本专利技术有益效果：本专利技术将绿色荧光蛋白标记法引入到厌氧发酵产沼气体系中，解决了厌氧发酵难于监测的问题，从微生物层面实现对发酵体系进行实时监控。本专利技术方法克服了厌氧发酵过程中微生物生物量及代谢活性在空间和时间的分布难以实时监测的问题，将GFP基因标记的工程菌应用于沼气发酵系统的监测，能够实现快速、准确监测发酵状态及检测发酵体系中的目标微生物，定量追踪微生物数量，及时发现发酵过程中的不稳定因素，从而进一步优化产气。附图说明图1为细胞密度与相对荧光密度相关性。图2为DSM5812-GFP随发酵时间变化。图3为原料预处理对微生物的影响。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步说明，但本专利技术不受实施例的限制。本专利技术方法是通过PCR扩增gfp基因序列，获得扩增产物；PCR扩增所利用的引物含有BamHI酶切位点；利用BamHI酶对pET15b质粒进行酶切处理，利用DNA连接酶将扩增产物连接到pET15b载体上，构建获得重组子pET15b-gfp；将重组子pET15b-gfp通过电转化转入宿主微生物细胞中，厌氧条件下进行培养；所述宿主微生物含有原核表达载体pET15b-gfp；宿主微生物为发酵体系本源微生物或者外源添加微生物，包括参与沼气代谢过程的水解型微生物、产酸产氢微生物、产乙酸微生物和产甲烷微生物；在荧光显微镜下挑选具有荧光的单克隆，获得GFP基因标记的工程菌；将GFP基因标记的工程菌添加至沼气发酵体系中，通过定时定点取样、测本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种实时监测沼气发酵体系的方法，其特征在于，通过扩增gfp基因、将其连接转化入宿主微生物中、筛选阳性克隆构建GFP基因标记的工程菌，然后将GFP基因标记的工程菌用于沼气发酵体系中，实时监测发酵系统。

【技术特征摘要】
1.一种实时监测沼气发酵体系的方法，其特征在于，通过扩增gfp基因、将其连接转化入宿
主微生物中、筛选阳性克隆构建GFP基因标记的工程菌，然后将GFP基因标记的工程菌用
于沼气发酵体系中，实时监测发酵系统。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述宿主微生物，为发酵体系本源微生物或者外
源添加微生物。
3.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述宿主微生物，含有原核表达载体
pET15b-gfp。
4.根据权利要求1或2或3所述方法，其特征在于，步骤如下：
1)通过PCR扩增gfp基因序列，获得扩增产物；
2)将步骤1)获得的扩增产物连接到pET15b载体上，构建获得重组子pET15b-gfp；
3)将步骤2)获得的重组子pET15b-gfp转入宿主微生物细胞中，培养后筛选阳性克隆，获得
GFP基因标记的工程菌；所述宿主微生物为发酵体系本源微生物或者外源添加微生物；
4)将步骤3)获得的GFP基因标记的工程菌添加到沼气发酵体系中，通过测定荧光值实时监
测发酵系统。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤1)所述PCR扩增所利用的引物含有BamHI
酶切位点。
6.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤3)所述宿主微生物，包括参与沼气代谢过程
的水解型微生物、产酸产氢微生物、产乙酸微生物或产甲烷微生物。
7.根据权利要求4...

【专利技术属性】
技术研发人员：李十中，韩娅新，张成明，姜立，陈雪兰，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京;11