多重RNA向导的基因组工程制造技术

本发明专利技术提供了在细胞中使用Cas9的多重基因组工程的方法，包括将编码与靶DNA互补的一种或多种RNA的第一外来核酸引入至细胞中并且该第一外来核酸向导酶至靶DNA的循环步骤，其中，该一种或多种RNA和该酶是用于靶DNA的共定位复合物的成员，以及将编码一种或多种供体核酸序列的第二外来核酸引入至细胞中，并且其中为了细胞中的多重DNA工程将循环重复期望的次数。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请数据本申请要求于2013年7月9日提交的美国临时专利申请号61/844,168的优先权，并且将其全部内容通过引证合并于此用于所有目的。政府利益的声明本专利技术是根据能源部的DE-FG02-02ER63445、国家科学基金会的NSF-SynBERC以及国家科学基金会的SA5283-11210的政府支持下完成的。政府对本专利技术具有一定的权利。
技术介绍
细菌和古细菌CRISPR-Cas体系(system)凭借短的向导RNA形成Cas蛋白复合物以指导存在于侵入的外来核酸内的互补序列的降解。参见Deltcheva，E.etal.CRISPRRNAmaturationbytrans-encodedsmallRNAandhostfactorRNaseIII.Nature471，602-607(2011)；Gasiunas,G，Barrangou,R.，Horvath,P.&Siksnys,V.Cas9-crRNAribonucleoproteincomplexmediatesspecificDNAcleavageforadaptiveimmunityinbacteria.proceedingsoftheNationalAcademyofSciences109,E2579-2586(2012)；Jinek,M.etal.Aprogrammabledual-RNA-guidedDNAendonucleaseinadaptivebacterialimmunity.Science337,816-821(2012)；Sapranauskas,R.etal.TheStreptococcusthermophilusCRISPR/CassystemprovidesimmunityinEscherichiacoli.Nucleicacidsresearch39,9275-9282(2011)；以及Bhaya,D.,Davison,M.&Barrangou,R.CRISPR-Cassystemsinbacteriaandarchaea:versatilesmallRNAsforadaptivedefenseandregulation.Annualreviewofgenetics45,273-297(2011)。最近化脓性链球菌(S.pyogenes)II型CRISPR体系的体外重构(reconstitution)证实了融合至正常反式编码的tracrRNA(“反式激活的CRISPRRNA”)的crRNA(“CRISPRRNA”)足以指导Cas9蛋白序列特异地切割匹配该crRNA的靶DNA序列。表达与靶位点同源的gRNA导致Cas9募集(recruitment)和靶DNA的降解。参见H.Deveauetal.,PhageresponsetoCRISPR-encodedresistanceinStreptococcusthermophilus.JournalofBacteriology190,1390(Feb,2008)。
技术实现思路
本公开内容的方面旨在使用一种或多种x向导RNA(核糖核酸)多重修饰在细胞中的DNA以指导由细胞表达的具有核酸酶活性的酶，如具有核酸酶活性的DNA结合蛋白，至该DNA(脱氧核糖核酸)上的靶位置(targetlocation)，其中，该酶剪切DNA并且使外源供体核酸插入至该DNA中，如通过同源重组。本公开内容的方面包括在细胞上循环或者重复DNA修饰步骤以生成在细胞内具有多重DNA修饰(modification)的细胞。修饰可以包括外源供体核酸的插入。通过引入编码多个RNA以及多个外源供体核酸的核酸至表达酶的细胞，如通过共转化(co-transformation)，的单一步骤，可以实现将多重外源核酸插入，其中表达该RNA并且其中在多个RNA中的每一个向导该酶至DNA的特定位点，该酶剪切DNA并且将多个外源核酸中的一个插入至在此剪切位点处的DNA。根据这个方面，在单一循环中产生了在细胞中的DNA的多种改变(alteration)或修饰。通过引入编码一种或多种RNA或多个RNA以及一种或多种外源核酸或多个外源核酸的一种或多种核酸至表达酶的细胞的重复步骤或循环，可以实现将多重外源核酸插入至细胞中，其中表达RNA并且向导该酶至DNA的特定位点，该酶剪切该DNA并且将外源核酸插入至在此剪切位点处的DNA，以使产生具有多重改变或具有外源DNA插入至在细胞内的DNA的细胞。根据一个方面，表达酶的细胞可以是表达天然的酶的细胞或者已经遗传地改变以表达酶(如通过引入编码该酶的核酸至细胞并且由该细胞可以将其表达)的细胞。以这样的方式，本公开内容的方面包括循环以下步骤：将RNA引入至表达酶的细胞，将外源供体核酸引入至细胞，表达该RNA，形成该RNA、该酶和DNA的共定位复合物(co-localizationcomplex)，通过酶酶促地剪切DNA，以及将供体核酸插入至该DNA。循环或者重复以上步骤导致在多重基因座(loci)处的细胞的多重遗传(genetic)修饰，即，具有多重遗传修饰的细胞。根据某些方面，通过循环以上描述的方法提供了增加同源重组率的方法。在一种实施方式中，基因组Cas9指导的DNA剪切经由戏剧性地提高同源重组率刺激了外源DNA。根据某些另外的方面，外源供体核酸包含同源序列(homologysequences)或者侧接剪切位点的臂(armsflankingthecutsite)。根据某些另外的方面，外源供体核酸包括除去剪切序列的序列。根据某些另外的方面，外源供体核酸包括同源序列或者侧接剪切位点的臂以及除去剪切位点的序列。以这样的方式，Cas9可以用作为针对不包含外源供体DNA的细胞的阴性选择(negativeselection)。因此，提供了用于鉴别具有高重组频率的细胞的阴性选择的方法。根据某些方面，在本公开内容的范围内的DNA结合蛋白或者酶包括与向导RNA形成复合物并且与gRNA一起向导复合物至双链DNA序列(其中该复合物结合至DNA序列)的蛋白。根据一个方面，该酶可以是RNA向导的DNA结合蛋白，如结合至DNA并且由RNA向导的II型CRISPR体系的RNA向导的DNA结合蛋白。根据一个方面，RNA向导的DNA结合蛋白是Cas9蛋白。本公开内容的这个方面可以被称作为RNA与DNA结合蛋白的共定位至双链DNA或与双链DNA一起共定位。以这样的方式，DNA结合蛋白-向导RNA复合物可以用于剪切双链DNA的多重位点以便生成具有多重遗传修饰，如外源供体DNA的多重插入的细胞。根据某些方面，提供了一种在表本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在表达酶的细胞中对靶DNA进行多重改变的方法，所述酶同与所述靶DNA互补的RNA形成共定位复合物并以位点特异性方式切割所述靶DNA，所述方法包括：(a)将编码与所述靶DNA互补的一种或多种RNA的第一外来核酸引入至所述细胞中，并且所述第一外来核酸向导所述酶至所述靶DNA，其中所述一种或多种RNA和所述酶是用于所述靶DNA的共定位复合物的成员，将编码一种或多种供体核酸序列的第二外来核酸引入至所述细胞中，其中，表达所述一种或多种RNA以及所述一种或多种供体核酸序列，其中，所述一种或多种RNA和所述酶共定位至所述靶DNA，所述酶切割所述靶DNA并且将所述供体核酸插入至所述靶DNA以在所述细胞中产生改变的DNA，以及将步骤(a)重复多次以在所述细胞中对于所述DNA产生多重改变。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.07.09 US 61/844,1681.一种在表达酶的细胞中对靶DNA进行多重改变的方法，所述酶同与所述靶DNA互补的
RNA形成共定位复合物并以位点特异性方式切割所述靶DNA，所述方法包括：
(a)将编码与所述靶DNA互补的一种或多种RNA的第一外来核酸引入至所述细胞中，并
且所述第一外来核酸向导所述酶至所述靶DNA，其中所述一种或多种RNA和所述酶是用于所
述靶DNA的共定位复合物的成员，
将编码一种或多种供体核酸序列的第二外来核酸引入至所述细胞中，
其中，表达所述一种或多种RNA以及所述一种或多种供体核酸序列，
其中，所述一种或多种RNA和所述酶共定位至所述靶DNA，所述酶切割所述靶DNA并且将
所述供体核酸插入至所述靶DNA以在所述细胞中产生改变的DNA，以及
将步骤(a)重复多次以在所述细胞中对于所述DNA产生多重改变。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述酶是RNA向导的DNA结合蛋白。
3.根据权利要求1所述的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔治·M·丘奇，詹姆士·迪卡洛，
申请(专利权)人：哈佛大学校长及研究员协会，
类型：发明
国别省市：美国;US