以核酸为靶的核酸的组合物和方法技术

本公开提供以核酸为靶的核酸及其复合体的组合物和使用方法。基因组工程学可提到通过缺失、插入、突变或置换特定的核酸序列来改变基因组。该改变可以是基因或位置特异性的。基因组工程学可利用核酸酶切割核酸，由此生成供改变的位点。也设想了非基因组核酸的工程学。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】交叉引用本申请要求2013年5月1日提交的美国临时申请No.61/818,386[代理人案号No.44287-710.101]、2013年11月11日提交的美国临时申请No.61/902,723[代理人案号No.44287-710.103]、2013年5月1日提交的美国临时申请No.61/818,382[代理人案号No.44287-712.101]、2013年7月29日提交的美国临时申请No.61/859,661[代理人案号No.44287-712.102]、2013年7月26日提交的美国临时申请No.61/858,767[代理人案号No.44287-713.102]、2013年5月10日提交的美国临时申请No.61/822,002[代理人案号No.44287-717.101]、2013年6月7日提交的美国临时申请No.61/832,690[代理人案号No.44287-719.101]、2013年11月19日提交的美国临时申请No.61/906,211[代理人案号No.44287-719.102]、2013年11月5日提交的美国临时申请No.61/900,311[代理人案号No.44287-719.103]、2013年7月12日提交的美国临时申请No.61/845,714[代理人案号No.44287-721.101]、2013年9月27日提交的美国临时申请No.61/883,804[代理人案号No.44287-721.102]、2013年3月14日提交的美国临时申请No.61/781,598[代理人案号No.44287-722.101]、2013年11月4日提交的美国临时申请No.61/899,712[代理人案号No.44287-727.101]、2013年8月14日提交的美国临时申请No.61/865,743[代理人案号No.44287-733.101]、2013年11月22日提交的美国临时申请No.61/907,777[代理人案号No.44287-734.101]、2013年11月12日提交的美国临时申请No.61/903,232[代理人案号No.44287-751.101]、2013年11月19日提交的美国临时申请No.61/906,335[代理人案号No.44287-752.101]、2013年11月21日提交的美国临时申请No.61/907,216[代理人案号No.44287-753.101]的权益，它们的整个内容经此引用并入本文。序列表本申请包含已经以ASCII格式电子提交并全文经此引用并入本文的序列表。在2014年3月10日创建的所述ASCII副本名为44287-722-601_SeqList且大小为7,828,964字节。专利技术背景基因组工程学可提到通过缺失、插入、突变或置换特定的核酸序列来改变基因组。该改变可以是基因或位置特异性的。基因组工程学可利用核酸酶切断核酸，由此生成供改变的位点。也设想了非基因组核酸的工程学。含核酸酶结构域的蛋白可通过与以核酸为靶的核酸(nucleic acid-targeting nucleic acids)形成复合体来结合和裂解靶核酸。在一个实例中，该裂解可以在靶核酸中引入双链断裂。可以例如通过内源性非同源末端连接(NHEJ)机制修复核酸。在另一实例中，可以插入一段核酸。以核酸为靶的核酸和定点多肽的N修饰(NModifications)可以引入用于基因组工程改造的新功能。专利技术概述一方面，本公开提供一种工程改造的以核酸为靶的核酸，其包含：在所述以核酸为靶的核酸的P-结构域中的突变。在一些实施方案中，所述P-结构域在所述以核酸为靶的核酸的CRISPR重复片段(repeat)与tracrRNA序列之间的双链体的最后一对核苷酸的下游开始。在一些实施方案中，所述工程改造的以核酸为靶的核酸进一步包含接头序列。在一些实施方案中，所述接头序列连接CRISPR重复片段和tracrRNA序列。在一些实施方案中，所述工程改造的以核酸为靶的核酸是分离的工程改造的以核酸为靶的核酸。在一些实施方案中，所述工程改造的以核酸为靶的核酸是重组的工程改造的以核酸为靶的核酸。在一些实施方案中，所述工程改造的以核酸为靶的核酸适合与靶核酸杂交。在一些实施方案中，所述P-结构域包含2个相邻核苷酸。在一些实施方案中，所述P-结构域包含3个相邻核苷酸。在一些实施方案中，所述P-结构域包含4个相邻核苷酸。在一些实施方案中，所述P-结构域包含5个相邻核苷酸。在一些实施方案中，所述P-结构域包含6个或更多个相邻核苷酸。在一些实施方案中，所述P-结构域在所述双链体的最后一对核苷酸下游1个核苷酸处开始。在一些实施方案中，所述P-结构域在所述双链体的最后一对核苷酸下游2个核苷酸处开始。在一些实施方案中，所述P-结构域在所述双链体的最后一对核苷酸下游3个核苷酸处开始。在一些实施方案中，所述P-结构域在所述双链体的最后一对核苷酸下游4个核苷酸处开始。在一些实施方案中，所述P-结构域在所述双链体的最后一对核苷酸下游5个核苷酸处开始。在一些实施方案中，所述P-结构域在所述双链体的最后一对核苷酸下游6个或更多个核苷酸处开始。在一些实施方案中，所述突变包含一个或多个突变。在一些实施方案中，所述一个或多个突变彼此相邻。在一些实施方案中，所述一个或多个突变彼此隔开。在一些实施方案中，所述突变适于使所述工程改造的以核酸为靶的核酸与不同的前间区序列邻近基序(protospacer adjacent motif)杂交。在一些实施方案中，所述不同的前间区序列邻近基序包含至少4个核苷酸。在一些实施方案中，所述不同的前间区序列邻近基序包含至少5个核苷酸。在一些实施方案中，所述不同的前间区序列邻近基序包含至少6个核苷酸。在一些实施方案中，所述不同的前间区序列邻近基序包含至少7个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，所述不同的前间区序列邻近基序包含两个不相邻区。在一些实施方案中，所述不同的前间区序列邻近基序包含三个不相邻区。在一些实施方案中，所述突变适于使所述工程改造的以核酸为靶的核酸以比未工程改造的以核酸为靶的核酸低的解离常数与靶核酸结合。在一些实施方案中，所述突变适于使所述工程改造的以核酸为靶的核酸以比未工程改造的以核酸为靶的核酸高的特异性与靶核酸结合。在一些实施方案中，与未工程改造的以核酸为靶的核酸相比所述突变适于减少所述工程改造的以核酸为靶的核酸与靶核酸中的非特异性序列的结合。在一些实施方案中，所述工程改造的以核酸为靶的核酸进一步包含两个发夹结构，其中这两个发夹结构之一包含在6个邻接核苷酸中包含与CRISPR RNA的至少50％同一性的多核苷酸和在6个邻接核苷酸中包含与tracrRNA的至少50％同一性的多核苷酸之间的双链体；并且，其中这两个发夹结构之一是第一个发夹结构的3’，其中第二个发夹结构包含工程改造的P-结构域。在一些实施方案中，第二个发夹结构适于在所述核酸与靶核酸接触时解双链。在一些实施方案中，所述P-结构域适于：与第一多核苷酸杂交，其中第一多核苷酸包含所述工程改造的以核酸为靶的核酸的区域，与第二多核苷酸杂交，其中第二多核苷酸包含靶核酸，和与第一或第二多核苷酸特异性地杂交。在一些实施本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测两种复合体是否彼此邻近的方法，其包括：(a)使第一靶核酸与第一复合体接触，其中所述第一复合体包含第一定点多肽、第一修饰的以核酸为靶的核酸和第一效应蛋白，其中所述效应蛋白适于与所述修饰的以核酸为靶的核酸结合，且其中所述第一效应蛋白包含含有分离体系的第一部分的非天然序列；和(b)使第二靶核酸与第二复合体接触，其中所述第二复合体包含第二定点多肽、第二修饰的以核酸为靶的核酸和第二效应蛋白，其中所述效应蛋白适于结合到所述修饰的以核酸为靶的核酸上，且其中所述第二效应蛋白包含含有分离体系的第二部分的非天然序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.03.14 US 61/781598;2013.05.01 US 61/818386;201.一种检测两种复合体是否彼此邻近的方法，其包括：(a)使第一靶核酸与第一复合体接触，其中所述第一复合体包含第一定点多肽、第一修饰的以核酸为靶的核酸和第一效应蛋白，其中所述效应蛋白适于与所述修饰的以核酸为靶的核酸结合，且其中所述第一效应蛋白包含含有分离体系的第一部分的非天然序列；和(b)使第二靶核酸与第二复合体接触，其中所述第二复合体包含第二定点多肽、第二修饰的以核酸为靶的核酸和第二效应蛋白，其中所述效应蛋白适于结合到所述修饰的以核酸为靶的核酸上，且其中所述第二效应蛋白包含含有分离体系的第二部分的非天然序列。2.权利要求1的方法，其中所述分离体系包含独立时无活性但在形成复合体时产生活性蛋白复合体的两个或更多个蛋白片段。3.权利要求1的方法，其进一步包括检测所述第一部分和所述第二部分之间的相互作用。4.权利要求3的方法，其中所述检测指示所述第一和第二复合体彼此邻近。5.权利要求3的方法，其中所述检测包含确定遗传移动事件的发生。6.权利要求5的方法，其中所述遗传移动事件包含易位。7.权利要求5的方法，其中在所述遗传移动事件之前，所述分离体系的所述两个部分不相互作用。8.权利要求5的方法，其中在所述遗传移动事件后，所述分离体系的所述两个部分相互作用。9.权利要求5的方法，其中所述遗传移动事件是BCR和Abl基因之间的易位。10.权利要求1的方法，其中所述分离体系选自：分离GFP体系、分离泛素体系、分离转录因子体系和分离亲和标记体系，或它们的任何组合。11.权利要求3的方法，其中所述检测指示基因型。12.权利要求11的方法，其进一步包括：基于所述基因型确定疾病的疗程。13.权利要求12的方法，其进一步包括治疗所述疾病。14.权利要求13的方法，其中所述治疗包含给药。15.权利要求13的方法，其中所述治疗包括给予包含以核酸为靶的核酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：AP梅，RE豪尔维茨，JA多纳，JM伯格，MM卡特，P多诺赫，
申请(专利权)人：卡里布生物科学公司，
类型：发明
国别省市：美国;US