工程改造的CRISPR‑CAS9组合物和使用方法技术

本说明书公开了工程改造的II型CRISPR‑Cas9‑缔合的分裂‑连结多核苷酸(sn‑casPN)系统，包括包含三个分裂‑连结多核苷酸(sn1‑casPN/sn2‑casPN/sn3‑casPN)的系统和包含两个分裂‑连结多核苷酸(sn1‑casPN/sn2‑casPN)的系统。与Cas9蛋白一起，sn‑casPN在体外和体内促进靶多核苷酸的位点特异性修饰，包括切割和诱变。此外，包含sn‑casPN的工程改造的II型CRISPR‑Cas9‑缔合的分裂‑连结多核苷酸系统可用于调节靶核酸的表达的方法。本文描述了用于产生包含两个或更多个sn‑casPN的各种工程改造的II型CRISPR‑Cas9‑缔合的分裂‑连结多核苷酸系统的方法。还描述了用于实施各种方法的多核苷酸序列、表达盒、载体、组合物和试剂盒。此外，本说明书提供了遗传修饰的细胞、修饰的细胞的组合物、转基因生物、药物组合物以及涉及工程改造的II型CRISPR‑Cas9‑缔合的分裂‑连结多核苷酸系统的各种组合物和方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】工程改造的CRISPR-CAS9组合物和使用方法相关申请的交叉引用本申请要求2015年8月7日提交的现在待审的美国临时专利申请系列号62/202,715和2015年8月24日提交的现在待审的美国临时专利申请系列号62/209,334的权益，其内容通过引用以其整体结合到本文中。关于联邦政府资助的研究或开发的声明不适用。序列表本申请包含以ASCII格式电子提交的序列表，其通过引用以其整体结合到本文中。ASCII副本，创建于2016年8月5日，名称为CBI017-30_ST25.txt和大小为51kb。
本专利技术涉及工程改造的II型CRISPR-Cas9-缔合的分裂-连结(split-nexus)多核苷酸、系统、组合物和使用方法。专利技术背景基因组工程改造包括通过缺失、插入、突变或置换特定的核酸序列改变基因组。所述改变可以是基因或位置特异性的。基因组工程改造可使用核酸酶切断DNA，由此产生用于改变的位点。在某些情况下，切割可在靶DNA中引入双链缺口。双链缺口可例如通过内源非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)进行修复。HDR依赖于用于修复的模板的存在。在基因组工程改造的一本文档来自技高网...

【技术保护点】
II型CRISPR‑Cas9‑缔合的分裂‑连结多核苷酸组合物，其包含：包含5'端和3'端的第一II型CRISPR‑Cas9‑缔合的分裂‑连结多核苷酸(sn1‑casPN)，其在5'至3'方向包含第一茎元件核苷酸序列I和连结茎元件核苷酸序列I；包含5'端和3'端的第二II型CRISPR‑Cas9‑缔合的分裂‑连结多核苷酸(sn2‑casPN)，其在5'至3'方向包含连结茎元件核苷酸序列II，其中sn1‑casPN的连结茎元件核苷酸序列I和sn2‑casPN的连结茎元件核苷酸序列II能够通过在连结茎元件核苷酸序列I和连结茎元件核苷酸序列II之间的碱基对氢键合形成连结茎元件；和包含5'端和3'端的第...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.08.07 US 62/202715;2015.08.24 US 62/2093341.II型CRISPR-Cas9-缔合的分裂-连结多核苷酸组合物，其包含：包含5'端和3'端的第一II型CRISPR-Cas9-缔合的分裂-连结多核苷酸(sn1-casPN)，其在5'至3'方向包含第一茎元件核苷酸序列I和连结茎元件核苷酸序列I；包含5'端和3'端的第二II型CRISPR-Cas9-缔合的分裂-连结多核苷酸(sn2-casPN)，其在5'至3'方向包含连结茎元件核苷酸序列II，其中sn1-casPN的连结茎元件核苷酸序列I和sn2-casPN的连结茎元件核苷酸序列II能够通过在连结茎元件核苷酸序列I和连结茎元件核苷酸序列II之间的碱基对氢键合形成连结茎元件；和包含5'端和3'端的第三II型CRISPR-Cas9-缔合的分裂-连结多核苷酸(sn3-casPN)，其在5'至3'方向包含核酸靶标结合序列和第一茎元件核苷酸序列II，其中sn1-casPN的第一茎元件核苷酸序列I和sn3-casPN的第一茎元件核苷酸序列II能够通过在第一茎元件核苷酸序列I和第一茎元件核苷酸序列II之间的碱基对氢键合形成第一茎元件。2.权利要求1的组合物，其中sn1-casPN的第一茎元件核苷酸序列I在5'至3'方向进一步包含上部茎元件核苷酸序列I、凸起元件核苷酸序列I和下部茎元件核苷酸序列I，和sn3-casPN的第一茎元件核苷酸序列II在5'至3'方向进一步包含下部茎元件核苷酸序列II、凸起元件核苷酸序列II和上部茎元件核苷酸序列II，其中sn1-casPN的上部茎元件核苷酸序列I和sn3-casPN的上部茎元件核苷酸序列II能够通过在上部茎元件核苷酸序列I和上部茎元件核苷酸序列II之间的碱基对氢键合形成上部茎元件，和sn1-casPN的下部茎元件核苷酸序列I和sn3-casPN的下部茎元件核苷酸序列II能够通过在下部茎元件核苷酸序列I和下部茎元件核苷酸序列II之间的碱基对氢键合形成下部茎元件。3.权利要求1或2的组合物，其进一步包含：包含5'端和3'端的第一附属多核苷酸，其包含第二茎元件核苷酸序列II；其中sn2-casPN在5'至3'方向包含连结茎元件核苷酸序列II和第二茎元件核苷酸序列I，和sn2-casPN的第二茎元件核苷酸序列I和第一附属多核苷酸的第二茎元件核苷酸序列II能够通过在第二茎元件核苷酸序列I和第二茎元件核苷酸序列II之间的碱基对氢键合形成第二茎元件。4.权利要求3的组合物，其中第一附属多核苷酸在5'至3'方向进一步包含环元件核苷酸序列和第二茎元件核苷酸序列II，和其中第一附属多核苷酸的5'端共价键合至sn2-casPN的3'端。5.权利要求1-4中任一项的组合物，进一步包含：包含5'端和3'端的第二附属多核苷酸，其包含第三茎元件核苷酸序列II；其中第一附属多核苷酸在5'至3'方向包含环元件核苷酸序列、第二茎元件核苷酸序列II和第三茎元件核苷酸序列I，和第一附属多核苷酸的第三茎元件核苷酸序列I和第二附属多核苷酸的第三茎元件核苷酸序列II能够通过在第三茎元件核苷酸序列I和第三茎元件核苷酸序列II之间的碱基对氢键合形成第三茎元件。6.权利要求5的组合物，其中第二附属多核苷酸在5'至3'方向进一步包含环元件核苷酸序列和第三茎元件核苷酸序列II，其中第二附属多核苷酸的5'端共价键合至第一附属多核苷酸的3'端。7.权利要求1-6中任一项的组合物，其中sn1-casPN进一步包含连结茎元件核苷酸序列I的3'邻近的第一辅助多核苷酸。8.权利要求1-7中任一项的组合物，其中sn2-casPN进一步包含连结茎元件核苷酸序列II的5'邻近的第二辅助多核苷酸。9.权利要求1-6中任一项的组合物，其中sn1-casPN进一步包含连结茎元件核苷酸序列I的3'邻近的第一辅助多核苷酸，和第一辅助多核苷酸进一步包含效应子结合元件核苷酸序列I，sn2-casPN进一步包含连结茎元件核苷酸序列II的5'邻近的第二辅助多核苷酸，和第二辅助多核苷酸进一步包含效应子结合元件核苷酸序列II，和第一辅助多核苷酸的效应子结合元件核苷酸序列I和第二辅助多核苷酸的效应子结合元件核苷酸序列II能够通过在效应子结合元件核苷酸序列I和效应子结合元件核苷酸序列II之间的碱基对氢键合形成效应子结合元件。10.权利要求9的组合物，其中第一辅助多核苷酸在5'至3'方向进一步包含接头元件核苷酸序列I和效应子结合元件核...

【专利技术属性】
技术研发人员：PD多纳休，AP梅，
申请(专利权)人：卡里布生物科学公司，
类型：发明
国别省市：美国,US