【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及核酸修饰酶领域，更具体地，涉及开发和测试活性核酸内切酶领域。关于联邦赞助研究的声明无。序列表占位符。
技术介绍
1、核酸内切酶是实验室实践和分子诊断行业中广泛使用的酶。设计和分离新的和改进的核酸内切酶的方法需要快速和方便的评估核酸内切酶活性的方法。最广泛使用的核酸内切酶测定是麻烦的和低通量的。此外，通常使用的方法不是定量的。没有常规手段来测量不同来源、变体或大量核酸内切酶之间的活性差异。类似地，没有简单或快速的手段来评估不同的靶标，以准确地确定核酸内切酶的特异性。
2、许多最先进的核酸内切酶测定不适用于粗细胞裂解物或部分纯化的蛋白质制备，因为宿主核酸酶会快速降解靶dna。在纯化过程的早期步骤中，对粗裂解物和半粗洗脱物进行快速内切酶测定的需求尚未得到满足。这种测定将有助于改进酶纯化和制造的努力并加速整个酶工程过程。
技术实现思路
1、本专利技术提供了用于评估核酸内切酶活性的方法、组合物和试剂盒。本专利技术利用由报告荧光基团和猝灭荧光基团标记的双链端保护的核酸底物。核酸外切酶水解底物并允许荧光仅在核酸内切酶切割底物后出现。
2、在一个实施方案中，本专利技术是用于检测核酸内切酶活性的核酸底物，其包括：供体荧光基团和受体荧光基团，所述荧光基团形成荧光共振能量转移(fret)对；在至少一条核酸链上的至少一个结构，其抑制核酸外切酶切割底物；以及核酸内切酶的识别序列。抑制核酸外切酶切割底物的结构选自：抑制3'-5'核酸外切酶切割的在每个3'端的结构，抑制5'
3、在一个实施方案中，本专利技术是用于检测核酸内切酶活性的组合物，其包括上述核酸底物和核酸外切酶，以及任选的核酸内切酶。在一些实施方案中，核酸内切酶是切口酶。在一些实施方案中，核酸外切酶选自：核酸外切酶iii、t5核酸外切酶、t7核酸外切酶、λ核酸外切酶和bal31核酸外切酶。在一些实施方案中，核酸外切酶能够从切口开始水解。在一些实施方案中，核酸外切酶选自：t5核酸外切酶、t7核酸外切酶、λ核酸外切酶、核酸外切酶iii和核酸外切酶bal31。在一些实施方案中，核酸内切酶是核酸引导的核酸内切酶。在一些实施方案中，核酸引导的核酸内切酶是cris本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于检测核酸内切酶活性的核酸底物，其包括：
2.根据权利要求1所述的底物，其中抑制核酸外切酶切割所述底物的所述至少一个结构选自：抑制3'-5'核酸外切酶切割的在每个3'端的结构，抑制5'-3'核酸外切酶切割的在每个5'端结构，或两者。
3.根据权利要求1所述的底物，其中所述核酸外切酶选自：核酸外切酶I、核酸外切酶III、核酸外切酶V、核酸外切酶VII、核酸外切酶VIII、T5核酸外切酶、T7核酸外切酶、λ核酸外切酶、核酸外切酶T、BAL-31核酸外切酶、RecJf核酸外切酶、RNA酶R、RNA酶II、RNA酶D、RNA酶T、RNA酶BN、RNA酶PH，核糖核酸外切酶I和核糖核酸外切酶II。
4.根据权利要求1所述的底物，其中所述受体荧光基团是猝灭荧光基团。
5.根据权利要求1所述的底物，其中所述供体荧光基团和所述受体荧光基团位置间隔1至12个核苷酸。
6.根据权利要求1所述的底物，其中所述供体荧光基团和所述受体荧光基团位于所述底物的同一链上。
7.根据权利要求1所述的底物，其中所述供体荧光基团和所述受体荧
8.根据权利要求1所述的底物，其由单链形成。
9.根据权利要求1所述的底物，其中所述供体荧光基团和所述受体荧光基团中的一个位于所述底物的5'端或在所述底物的5'端附近。
10.根据权利要求1所述的底物，其中所述供体荧光基团选自：5-羧基荧光素(5-FAM)、6-羧基荧光素(6-FAM)、2',4',1,4'-四氯荧光素(TET)、2',4',5',7',1,4-六氯荧光素(HEX)、2',7'-二甲氧基-4',5'-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、香豆素染料、Alexa Fluor染料、IRDye 800CW、级联蓝、太平洋蓝、太平洋橙、德克萨斯红和染料。
11.根据权利要求1所述的底物，其中所述受体荧光基团选自：四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、四丙烷-6-羧基罗丹明(ROX)、DABSYL、DABCYL(4-[[4-(二甲基氨基)-苯基]-偶氮]-苯甲酸)、Cy5和Cy5.5、蒽醌染料、硝基噻唑染料、硝基咪唑染料、LC-Red 610、LC-Red640、LC-Red 705、JA286、DDQ-I、DDQ-II、QSY-7、QSY-21、IRDye QC1、Iowa Black FQ、IowaBlack RQ、HEX(六氯荧光素)、TET(四氯荧光素)、JOE(5'-二氯-二甲氧基-荧光素)、染料、Eclipse Quencher(4-[[2-氯-4-硝基-苯基]-偶氮]-苯胺、BHQ-1([(4-(2-硝基-4-甲基-苯基)-偶氮)-基]-((2-甲氧基-5-甲基-苯基)-偶氮)]-苯胺)、BHQ-2([(4-(1-硝基-苯基)-偶氮)-基]-((2,5-二甲氧基-苯基)-偶氮)]-苯胺)和吡啶基-异喹啉-二酮染料。
12.根据权利要求1所述的底物，其中所述核酸内切酶是切口酶。
13.根据权利要求12所述的底物，其中所述核酸外切酶选自：核酸外切酶III、T5核酸外切酶、T7核酸外切酶、λ核酸外切酶和BAL31核酸外切酶。
14.根据权利要求1所述的底物，其中所述核酸内切酶是核酸引导的核酸内切酶。
15.根据权利要求14所述的底物，其中所述核酸引导的核酸内切酶是CRISPRI类(CASCADE)核酸内切酶。
16.根据权利要求15所述的底物，其包括原间隔相邻基序(PAM)。
17.根据权利要求16所述的底物，其中所述原间隔相邻基序(PAM)由选自以下的序列组成：5'-AAG-3'、5'-AGG-3'、5'-ATG-3'、5'-GAG-3'、5'-CAG-3'、5'-GTG-3'、5'-TAA-3'、5'-TGG-3'、5'-AAA-3'、5'-AAC-3'、5'-AAT-3'、5'-ATA-3'、5'-TAG-3'和5'-TTG-3'。
18.根据权利要求1所述的底物，其中所述核酸引导的核酸内切酶是CRISPRII类核酸内切酶。
19.根据权利要求18所述的底物，其中所述核酸引导的核酸内切酶是CRISPR Cas9核酸内切酶。
20.根据权利要求19所述的底物，其中所述核酸引导的核酸内切酶是CRISPR Cas12a核酸内切酶。
21.根据权利要求20所述的底物，其包括原间隔相邻基序(PAM)。
22.根据权利要求21所述的底物，其中所述原间隔相邻基序(PAM)由选自以下的序列组成：5'-NGG-3'、5'-NGGNG-3'、5...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.用于检测核酸内切酶活性的核酸底物，其包括：
2.根据权利要求1所述的底物，其中抑制核酸外切酶切割所述底物的所述至少一个结构选自：抑制3'-5'核酸外切酶切割的在每个3'端的结构，抑制5'-3'核酸外切酶切割的在每个5'端结构，或两者。
3.根据权利要求1所述的底物，其中所述核酸外切酶选自：核酸外切酶i、核酸外切酶iii、核酸外切酶v、核酸外切酶vii、核酸外切酶viii、t5核酸外切酶、t7核酸外切酶、λ核酸外切酶、核酸外切酶t、bal-31核酸外切酶、recjf核酸外切酶、rna酶r、rna酶ii、rna酶d、rna酶t、rna酶bn、rna酶ph，核糖核酸外切酶i和核糖核酸外切酶ii。
4.根据权利要求1所述的底物，其中所述受体荧光基团是猝灭荧光基团。
5.根据权利要求1所述的底物，其中所述供体荧光基团和所述受体荧光基团位置间隔1至12个核苷酸。
6.根据权利要求1所述的底物，其中所述供体荧光基团和所述受体荧光基团位于所述底物的同一链上。
7.根据权利要求1所述的底物，其中所述供体荧光基团和所述受体荧光基团位于所述底物的不同链上。
8.根据权利要求1所述的底物，其由单链形成。
9.根据权利要求1所述的底物，其中所述供体荧光基团和所述受体荧光基团中的一个位于所述底物的5'端或在所述底物的5'端附近。
10.根据权利要求1所述的底物，其中所述供体荧光基团选自：5-羧基荧光素(5-fam)、6-羧基荧光素(6-fam)、2',4',1,4'-四氯荧光素(tet)、2',4',5',7',1,4-六氯荧光素(hex)、2',7'-二甲氧基-4',5'-二氯-6-羧基荧光素(joe)、香豆素染料、alexa fluor染料、irdye 800cw、级联蓝、太平洋蓝、太平洋橙、德克萨斯红和染料。
11.根据权利要求1所述的底物，其中所述受体荧光基团选自：四甲基-6-羧基罗丹明(tamra)、四丙烷-6-羧基罗丹明(rox)、dabsyl、dabcyl(4-[[4-(二甲基氨基)-苯基]-偶氮]-苯甲酸)、cy5和cy5.5、蒽醌染料、硝基噻唑染料、硝基咪唑染料、lc-red 610、lc-red640、lc-red 705、ja286、ddq-i、ddq-ii、qsy-7、qsy-21、irdye qc1、iowa black fq、iowablack rq、hex(六氯荧光素)、tet(四氯荧光素)、joe(5'-二氯-二甲氧基-荧光素)、染料、eclipse quencher(4-[[2-氯-4-硝基-苯基]-偶氮]-苯胺、bhq-1([(4-(2-硝基-4-甲基-苯基)-偶氮)-基]-((2-甲氧基-5-甲基-苯基)-偶氮)]-苯胺)、bhq-2([(4-(1-硝基-苯基)-偶氮)-基]-((2,5-二甲氧基-苯基)-偶氮)]-苯胺)和吡啶基-异喹啉-二酮染料。
12.根据权利要求1所述的底物，其中所述核酸内切酶是切口酶。
13.根据权利要求12所述的底物，其中所述核酸外切酶选自：核酸外切酶iii、t5核酸外切酶、t7核酸外切酶、λ核酸外切酶和bal31核酸外切酶。
14.根据权利要求1所述的底物，其中所述核酸内切酶是核酸引导的核酸内切酶。
15.根据权利要求14所述的底物，其中所述核酸引导的核酸内切酶是crispri类(cascade)核酸内切酶。
16.根据权利要求15所述的底物，其包括原间隔相邻基序(pam)。
17.根据权利要求16所述的底物，其中所述原间隔相邻基序(pam)由选自以下的序列组成：5'-aag-3'、5'-agg-3'、5'-atg-3'、5'-gag-3'、5'-cag-3'、5'-gtg-3'、5'-taa-3'、5'-tgg-3'、5'-aaa-3'、5'-aac-3'、5'-aat-3'、5'-ata-3'、5'-tag-3'和5'-ttg-3'。
18.根据权利要求1所述的底物，其中所述核酸引导的核酸内切酶是crisprii类核酸内切酶。
19.根据权利要求18所述的底物，其中所述核酸引导的核酸内切酶是crispr cas9核酸内切酶。
20.根据权利要求19所述的底物，其中所述核酸引导的核酸内切酶是crispr cas12a核酸内切酶。
21.根据权利要求20所述的底物，其包括原间隔相邻基序(pam)。
22.根据权利要求21所述的底物，其中所述原间隔相邻基序(pam)由选自以下的序列组成：5'-ngg-3'、5'-nggng-3'、5'-nnaaaaw-3'、5'-nnnngatt-3'、5'-gnnncnna-3'和5'-nnnaca-3'。
23.根据权利要求21所述的底物，其中所述原间隔相邻基序(pam)由选自以下的序列组成：5'-ttn-3'、5'-tttn-3'和5'-tttv-3'。
24.根据权利要求14所述的底物，其中所述核酸引导的核酸内切酶包括核酸内切酶和核酸靶向核酸(natna)。
25.根据权利要求24所述的底物，其中所述natna是选自单向导和双向导的crispr向导rna。
26.根据权利要求24所述的底物，其中所述natna包括crrna和tracrrna。
27.根据权利要求24所述的底物，其中所述natna包括能够与所述底物的区域杂交的靶向区域。
28.根据权利要求24所述的底物，其中所述natna能够与所述核酸内切酶相互作用。
29.根据权利要求24所述的底物，其中所述natna包括dna和rna核苷酸。
30.根据权利要求1所述的底物，其中所述核酸内切酶选自：锌指核酸酶(zfn)、与foki缀合的zfn、类转录活化因子核酸酶(talen)、endo tt核酸内切酶、argonaute核酸内切酶、arcus核酸内切酶，选自rna酶iii、rna酶a、rna酶t1、rna酶a、rna酶h、rna酶z和rna酶p的核糖核酸内切酶，cas3和cas7-11，以及限制性核酸内切酶。
31.根据权利要求1所述的底物，其中抑制核酸外切酶切割所述底物的所述结构选自发夹、链突出部分和核酸修饰。
32.根据权利要求31所述的底物，其中所述核酸修饰包括一个或多个硫代磷酸酯键。
33.根据权利要求32所述的底物，其中所述核酸修饰包括5个或更多个硫代磷酸酯键。
34.根据权利要求1所述的底物，其中所述核酸内切酶是脱氧核糖核酸酶，并且所述底物含有dna。
35.根据权利要求1所述的底物，其中所述核酸内切酶是核糖核酸酶，并且所述底物含有rna。
36.根据权利要求35所述的底物，其中所述核糖核酸酶选自：核酶、锤头状核酶、dna酶、pnazyme或工程化的核糖核酸内切酶。
37.用于检测核酸内切酶活性的组合物，其包括权利要求1所述的核酸底物，并且进一步包括所述核酸外切酶。
38.根据权利要求37所述的组合物，其进一步包括核酸内切酶。
39.根据权利要求38所述的组合物，其中所述核酸内切酶是切口酶。
40.根据权利要求37所述的组合物，其中所述核酸外切酶选自：核酸外切酶iii、t5核酸外切酶、t7核酸外切酶、λ核酸外切酶和bal31核酸外切酶。
41.根据权利要求37所述的组合物，其中所述核酸外切酶能够从切口开始水解。
42.根据权利要求37所述的组合物，其中所述核酸外切酶选自：t5核酸外切酶、t7核酸外切酶、λ核酸外切酶、核酸外切酶iii、核酸外切酶bal31、rna酶r、rna酶ii、rna酶d、rna酶t、rna酶bn、rna酶ph、核糖核酸外切酶i和核糖核酸外切酶ii。
43.根据权利要求37所述的组合物，其中所述核酸内切酶是核酸引导的核酸内切酶。
44.根据权利要求43所述的组合物，其中所述核酸引导的核酸内切酶是crispri类(cascade)核酸内切酶，并且所述底物包括原间隔相邻基序(pam)，所述原间隔相邻基序(pam)由选自以下的序列组成：5'-aag-3'、5'-agg-3'、5'-atg-3'、5'-gag-3'、5'-gag-3'、5'-cag-3'、5'-gtg-3'、5'-taa-3'、5'-tgg-3'、5'-aaa-3'、5'-aac-3'、5'-aat-3'、5'-ata-3'、5'-tag-3'和5'-ttg-3'。
45.根据权利要求43所述的组合物，其中所述核酸引导的核酸内切酶是crispr cas9核酸内切酶或crispr cas12a核酸内切酶，并且所述底物包括原间隔相邻基序(pam)，所述原间隔相邻基序(pam)由选自以下的序列组成：5'-ngg-3'、5'-nggng-3'、5'-nnaaaaw-3'、5'-nnnngatt-3'、5'-gnnncnna-3'、5'-nnnaca-3'、5'-ttn-3'、5'-tttn-3'和5'-tttv-3'。
46.根据权利要求43所述的组合物，其中所述核酸引导的核酸内切酶包括核酸内切酶和核酸靶向核酸(natna)。
47.根据权利要求46所述的组合物，其中所述natna是选自单向导和双向导的crispr向导rna。
48.根据权利要求46所述的组合物，其中所述natna包括crrna和tracrrna。
49.根据权利要求46所述的组合物，其中所述natna包括能够与所述底物的区域杂交的靶向区域。
50.根据权利要求46所述的组合物，其中所述natna能够与所述核酸内切酶相互作用。
51.根据权利要求46所述的组合物，其中所述natna包括dna和rna核苷酸。
52.根据权利要求37所述的组合物，其中所述核酸内切酶选自：锌指核酸酶(zfn)、与fok i缀合的zfn、类转录活化因子核酸酶(talen)、endo tt核酸内切酶、argonaute核酸内切酶、arcus核酸内切酶，选自rna酶iii、rna酶a、rna酶t1、rna酶a、rna酶h、rna酶z和rna酶p的核糖核酸内切酶、cas3和cas7-11、以及限制性核酸内切酶。
53.根据权利要求37所述的组合物，其中抑制核酸外切酶切割所述底物的所述结构选自发夹，链突出部分和核酸修饰。
54.根据权利要求53所述的组合物，其中所述核酸修饰包括一个或多个硫代磷酸酯键。
55.根据权利要求54所述的组合物，其中所述核酸修饰包括5个或更多个硫代磷酸酯键。
56.用于检测核酸内切酶的活性的方法，其包括：
57.根据权利要求56所述的方法，其中抑制核酸外切酶切割所述底物的所述至少一个结构选自：抑制3'-5'核酸外切酶切割的在每个3'端的结构，抑制5'-3'核酸外切酶切割的在每个5'端的结构，或两者均有。
58.根据权利要求56所述的方法，其中所述核酸外切酶选自：核酸外切酶i、核酸外切酶iii、核酸外切酶v、核酸外切酶vii、核酸外切酶viii、t5核酸外切酶、t7核酸外切酶、λ核酸外切酶、核酸外切酶t、bal-31核酸外切酶、recjf核酸外切酶、rna酶r、rna酶ii、rna酶d、rna酶t、rna酶bn、rna酶ph，核糖核酸外切酶i和核糖核酸外切酶ii。
59.根据权利要求56所述的方法，其中所述反应混合物同时与所述核酸内切酶和所述核酸外切酶接触。
60.根据权利要求56所述的方法，其中所述反应混合物首先与核酸内切酶接触，随后与核酸外切酶接触。
61.根据权利要求56所述的方法，其中在所述反应混合物与所述核酸内切酶接触和所述反应混合物与所述核酸外切酶接触之间不进行纯化步骤。
62.根据权利要求56所述的方法，其中所述核酸内切酶是核酸引导的核酸内切酶。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述核酸引导的核酸内切酶是crispri类(cascade)核酸内切酶，并且所述底物包括原间隔相邻基序(pam)，所述原间隔相邻基序(pam)由选自以下的序列组成：5'-aag-3'、5'-agg-3'、5'-atg-3'、5'-gag-3'、5'-gag-3'、5'-cag-3'、5'-gtg-3'、5'-taa-3'、5'-tgg-3'、5'-aaa-3'、5'-aac-3'、5'-aat-3'、5'-ata-3'、5'-tag-3'和5'-ttg-3'。
64.根据权利要求62所述的方法，其中所述核酸引导的核酸内切酶是crispr cas9核酸内切酶或crispr cas12a核酸内切酶，并且所述底物包括原间隔相邻基序(pam)，所述原间隔相邻基序(pam)由选自以下的序列组成：5'-ngg-3'、5'-nggng-3'、5'-nnaaaaw-3'、5'-nnnngatt-3'、5'-gnnncnna-3'、5'-nnnaca-3'、5'-ttn-3'、5'-tttn-3'和5'-tttv-3'。
65.根据权利要求62所述的方法，其中所述核酸引导的核酸内切酶包括核酸内切酶和核酸靶向核酸(natna)。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述natna是选自单向导和双向导的crispr向导rna。
67.根据权利要求65所述的方法，其中所述natna包括crrna和tracrrna。
68.根据权利要求65所述的方法，其中所述natna包括能够与所述底物的区域杂交的靶向区域。
69.根据权利要求65所述的方法，其中所述natna能够与所述核酸内切酶相互作用。
70.根据权利要求65所述的方法，其中所述natna包括dna和rna核苷酸。
71.根据权利要求56所述的方法，其中步骤(a)中所述的接触包括使包括相同natna的一系列反应混合物与一系列不同的核酸内切酶接触。
72.根据权利要求56所述的方法，其中步骤(a)中所述的接触包括使包括相同核酸内切酶的一系列反应混合物与一系列不同的natna接触。
73.根据权利要求56所述的方法，其中步骤(a)中所述的接触包括在不同的反应条件下使包括相同成分的一系列反应混合物接触。
74.根据权利要求56所述的方法，其中步骤(a)中所述的接触包括使包括相同成分的一系列反应混合物与不同的核酸内切酶分离物接触。
75.根据权利要求56所述的方法，其中步骤(a)中所述的接触包括使包括相同核酸内切酶的一系列反应混合物与包括不同序列的一系列不同核酸底物接触。
76.根据权利要求56所述的方法，其中所述核酸内切酶选自：锌指核酸酶(zfn)、与foki缀合的zfn、类转录活化因子核酸酶(talen)、endo tt核酸内切酶、argonaute核酸内切酶、arcus核酸内切酶，选自rna酶iii、rna酶a、rna酶t1、rna酶a、rna酶h、rna酶z和rna酶p的核糖核酸内切酶、cas3和cas7-11、以及限制性核酸内切酶。
77.根据权利要求56所述的方法，其中抑制核酸外切酶切割所述底物的所述结构选自发夹、链突出部分和核酸修饰。
78.根据权利要求77所述的方法，其中所述核酸修饰包括一个或多个硫代磷酸酯键。
79.根据权利要求78所述的方法，其中所述核酸修饰包括5个或更多个硫代磷酸酯键。
80.根据权利要求56所述的方法，其中所述核酸底物或所述核酸内切酶为未纯化的形式。
81.用于检测核酸内切酶的活性的试剂盒，其包括：
82.根据权利要求81所述的试剂盒，其中抑制核酸外切酶切割所述底物的所述至少一个结构选自：抑制3'-5'核酸外切酶切割的在每个3'端的结构，抑制5'-3'核酸外切酶切割的在每个5'端的结构，或两者均有。
83.根据权利要求81所述的试剂盒，其中所述核酸外切酶选自：核酸外切酶i、核酸外切酶iii、核酸外切酶v、核酸外切酶vii、核酸外切酶viii、t5核酸外切酶、t7核酸外切酶、λ核酸外切酶、核酸外切酶t、bal-31核酸外切酶、recjf核酸外切酶、rna酶r、rna酶ii、rna酶d、rna酶t、rna酶bn、rna酶ph、核糖核酸外切酶i和核糖核酸外切酶ii。
84.根据权利要求81所述的试剂盒，其中所述待测的核酸内切酶是核酸引导的核酸内切酶。
85.根据权利要求84所述的试剂盒，其中所述核酸引导的核酸内切酶是crispri类(cascade)核酸内切酶，并且所述底物包括原间隔相邻基序(pam)，所述原间隔相邻基序(pam)由选自以下的序列组成：5'-aag-3'、5'-agg-3'、5'-atg-3'、5'-gag-3'、5'-cag-3'、5'-gtg-3'、5'-taa-3'、5'-tgg-3'、5'-aaa-3'、5'-aac-3'、5'-aat-3'、5'-ata-3'、5'-tag-3'和5'-ttg-3'。
86.根据权利要求84所述的试剂盒，其中所述核酸引导的核酸内切酶是crispr cas9核酸内切酶或crispr cas12a核酸内切酶，并且所述底物包括原间隔相邻基序(pam)，所述原间隔相邻基序(pam)由选自以下的序列组成：5'-ngg-3'、5'-nggng-3'、5'-nnaaaaw-3'、5'-nnnngatt-3'、5'-gnnncnna-3'、5'-nnnaca-3'、5'-ttn-3'、5'-tttn-3'和5'-tttv-3'。
87.根据权利要求84所述的试剂盒，其进一步包括能够与所述待测的核酸内切酶形成复合物的核酸靶向核酸(natna)。
88.根据权利要求87所述的试剂盒，其中所述natna是选自单向导和双向导的crispr向导rna。
89.根据权利要求87所述的试剂盒，其中所述natna包括crrna和tracrrna。
90.根据权利要求87所述的试剂盒，其中所述natna包括能够与所述底物的区域杂交的靶向区域。
91.根据权利要求87所述的试剂盒，其中所述natna能够与所述核酸内切酶相互作用。
92.根据权利要求87所述的试剂盒，其中所述natna包括dna和rna核苷酸。
93.根据权利要求81所述的试剂盒，其中所述核酸内切酶选自：锌指核酸酶(zfn)、与fok i缀合的zfn、类转录活化因子核酸酶(talen)、endo tt核酸内切酶、argonaute核酸内切酶、arcus核酸内切酶、选自rna酶iii、rna酶a、rna酶t1、rna酶a、rna酶h、rna酶z和rna酶p的核糖核酸内切酶，cas3和cas7-11，以及限制性核酸内切酶。
94.根据权利要求81所述的试剂盒，其中抑制核酸外切酶切割所述底物的所述结构选自发夹、链突出部分和核酸修饰。
95.根据权利要求94所述的试剂盒，其中所述核酸修饰包括一个或多个硫代磷酸酯键。
96.根据权利要求95所述的试剂盒，其中所述核酸修饰包括5个或更多个硫代磷酸酯键。
97.使用权利要求1所述的底物检测核酸内切酶活性的设备，其包括：用于进行酶反应的反应室和荧光检测器。
98.用于检测样品中靶核酸的存在的方法，所述方法包括：
99.根据权利要求98所述的方法，其中抑制核酸外切酶切割所述探针的所述至少一个结构选自：抑制3'-5'核酸外切酶切割的在每个3'端的结构，抑制5'-3'核酸外切酶切割的在每个5'端的结构，或两者均有。
100.根据权利要求98所述的方法，其中所述核酸外切酶选自：核酸外切酶i、核酸外切酶iii、核酸外切酶v、核酸外切酶vii、核酸外切酶viii、t5核酸外切酶、t7核酸外切酶、λ核酸外切酶、核酸外切酶t、bal-31核酸外切酶、recjf核酸外切酶、rna酶r、rna酶ii、rna酶d、rna酶t、rna酶bn、rna酶ph、核糖核酸外切酶i和核糖核酸外切酶ii。
101.根据权利要求98所述的方法，其中所述靶核酸选自：细菌的序列特征、病毒的序列特征、寄生虫的序列特征以及患者的疾病或患者的病症的特征。
102.根据权利要求98所述的方法，其中所述核酸内切酶是核酸引导的核酸内切酶。
103.根据权利要求102所述的方法，其中所述核酸引导的核酸内切酶是crispri类(cascade)核酸内切酶，并且所述探针包括原间隔相邻基序(pam)，所述原间隔相邻基序(pam)由选自以下的序列组成：5'-aag-3'、5'-agg-3'、5'-atg-3'、5'-gag-3'、5'-gag-3'、5'-cag-3'、5'-gtg-3'、5'-taa-3'、5'-tgg-3'、5'-aaa-3'、5'-aac-3'、5'-aat-3'、5'-ata-3'、5'-tag-3'和5'-ttg-3'。
104.根据权利要求102所述的方法，其中所述核酸引导的核酸内切酶是crispr cas9核酸内切酶或crispr cas12a核酸内切酶，并且所述探针包括原间隔相邻基序(pam)，所述原间隔相邻基序(pam)由选自以下的序列组成：5'-ngg-3'、5'-nggng-3'、5'-nnaaaaw-3'、5'-nnnngatt-3'、5'-gnnncnna-3'、5'-nnnaca-3'、5'-ttn-3'、5'-tttn-3'和5'-tttv-3'。
105.根据权利要求102所述的方法，其中所述核酸引导的核酸内切酶包括核酸内切酶和核酸靶向核酸(natna)。
106.根据权利要求105所述的方法，其中所述natna是选自单向导和双向导的crispr向导rna。
107.根据权利要求105所述的方法，其中所述natna包括crrna和tracrrna。
108.根据权利要求105所述的方法，其中所述natna包括能够与所述探针的区域杂交的靶向区域。
109.根据权利要求105所述的方法，其中所述natna能够与所述核酸内切酶相互作用。
110.根据权利要求105所述的方法，其中所述natna包括dna和rna核苷酸。
111.根据权利要求98所述的方法，其中所述核酸内切酶选自：锌指核酸酶(zfn)、与foki缀合的zfn、类转录活化因子核酸酶(talen)、endo tt核酸内切酶、argonaute核酸内切酶、arcus核酸内切酶、选自rna酶iii、rna酶a、rna酶t1、rna酶a、rna酶h、rna酶z和rna酶p的核糖核酸内切酶，cas3和cas7-11，以及限制性核酸内切酶。
112.根据权利要求98所述的方法，其中抑制核酸外切酶切割所述探针的所述结构选自发夹、链突出部分和核酸修饰。
113.根据权利要求112所述的方法，其中所述核酸修饰包括一个或多个硫代磷酸酯键。
114.根据权利要求113所述的方法，其中所述核酸修饰包括5个或更多个硫代磷酸酯键。
115.根据权利要求98所述的方法，其中所述样品包括核酸的粗制品。
116.用于检测样品中两种或更多种靶核酸的存在的方法，所述方法包括：
117.根据权利要求116所述的方法，其中所述两个或更多个核酸探针中的每一个包括至少一个不同的荧光基团。
118.根据权利要求116所述的...
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