一种杏鲍菇菌种鉴别的方法及专用DNA条形码片段技术

本发明专利技术公开了一种杏鲍菇菌种鉴别的方法及专用DNA条形码片段。本发明专利技术提供了DNA片段，为如下1)或2)：1)、序列3所示的DNA片段；2)、为与1)所示片段的核苷酸序列同源性大于99％的片段。本发明专利技术提供的杏鲍菇DNA条形码片段，其可以用于鉴别杏鲍菇菌种，用该片段鉴别有利于缩短杏鲍菇菌种鉴定时间，提高鉴定准确性，用该方法最快48小时可以准确鉴定杏鲍菇菌种，避免栽培出菇以后才发现菌种错误的后果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种杏鲍菇菌种鉴别的方法及专用DNA条形码片段。
技术介绍
改革开放以来，我国食用菌产业迅速发展，已成为世界上最大的食用菌生产大国。杏鲍菇是近年来栽培成功的集食用、药用、食疗于一体的珍稀食用菌新品种。杏鲍菇营养丰富，富含蛋白质、碳水化合物、维生素及钙、镁、铜、锌等矿物质，可以提高人体免疫功能，对人体具有抗肿瘤、降血脂、润肠胃以及美容等作用。菌种在杏鲍菇产业的发展中起着重要的、不可替代的作用。近年来菌种事故多数是菌种错误造成的，不法从业者利用假冒伪劣菌种扰乱市场，谋取不当利益。因此，杏鲍菇菌种的真实性检测显得至关重要。常规检测手段主要有：肉眼感官观察、菌丝生长速度、农艺性状和商品性状检验、同工酶电泳法、ISSR法等。这些方法耗时多，具有一定的组织与发育阶段的特异性，结果不可靠。DNA条形码技术利用一段通用的DNA序列，对物种进行快速准确鉴定。该技术鉴定样品不受其生长发育阶段影响、所需材料少，简单便捷，所需时间短，结果可靠，可以实现对杏鲍菇菌种快速准确的物种鉴定。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种DNA片段。本专利技术提供的DNA片段，为如下1)或2)或3)：1)、序列3所示的DNA片段；2)、序列3第21-374位核苷酸所示的DNA片段；3)、为与1)或2)所示片段的核苷酸序列同源性大于99％的片段。本专利技术的另一个目的是提供所述DNA片段的新用途。本专利技术提供了所述DNA片段在鉴别或辅助鉴别杏鲍菇菌种中的应用。本专利技术第3个目的是提供检测杏鲍菇菌种基因组中是否含有所述DNA片段的物质的新用途。本专利技术提供了检测杏鲍菇菌种基因组中是否含有所述DNA片段的物质在鉴别杏鲍菇菌种中的应用。上述应用中，所述检测杏鲍菇菌种基因组中是否含有所述DNA片段的物质为如下1)或2)：1)用于扩增所述DNA条形码片段的引物对；2)含有所述引物对的PCR试剂或试剂盒。上述应用中，所述引物对由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成。或所述PCR试剂中，所述引物1和所述引物2的摩尔比为1:1。或所述PCR试剂中，所述引物1和所述引物2的浓度均为10μmol/L。本专利技术第4个目的是提供一种鉴别或辅助鉴别杏鲍菇菌种的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤：检测待测样品中是否含有所述DNA片段；如果含有，则待测样品为或候选为杏鲍菇菌种；如果不含有，则待测样品不为或候选不为杏鲍菇菌种。上述方法中，所述检测待测样品中是否含有所述DNA片段的方法包括如下步骤：1)用序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成的引物对对待测样品进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；2)测序所述PCR扩增产物，将所述PCR扩增产物的序列与所述DNA片段进行比对，若同源性大于99％，则待测样品中含有所述DNA片段，若同源性小于等于99％，则待测样品中不含有所述DNA片段。上述方法中，所述PCR扩增的模板为待测样品的基因组DNA。本专利技术第5个目的是提供检测杏鲍菇菌种基因组中是否含有所述DNA片段的物质。本专利技术提供的检测杏鲍菇菌种基因组中是否含有所述DNA片段的物质，其为如下1)或2)：1)用于扩增所述DNA条形码片段的引物对；2)含有所述引物对的PCR试剂或试剂盒。上述物质中，所述引物对由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成。或所述PCR试剂中，所述引物1和所述引物2的摩尔比为1:1。或所述PCR试剂中，所述引物1和所述引物2的浓度均为10μmol/L。为克服感官检验、栽培试验、生化及传统分子标记鉴定杏鲍菇菌种的缺陷，本专利技术提供了一种杏鲍菇(Pleurotus eryngii)菌种DNA条形码鉴定方法，可以快速准确地鉴别杏鲍菇菌种。本专利技术的实验证明，本专利技术提供的杏鲍菇DNA条形码片段，其可以用于鉴别杏鲍菇菌种，用该片段鉴别有利于缩短杏鲍菇菌种鉴定时间，提高鉴定准确性。用该方法最快48小时可以准确鉴定杏鲍菇菌种，避免栽培出菇以后才发现菌种错误的后果。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、杏鲍菇菌种鉴别DNA条形码片段的获得及方法的建立1、杏鲍菇菌种的基因组DNA获得提取杏鲍菇菌种的基因组DNA。2、PCR扩增以上述1得到的基因组DNA为模板，用引物728F和引物1567R进行PCR扩增。728F：5'-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3'(序列1)1567R：5'-ACHGTRCCRATACCACCRATCTT-3’(序列2)上述PCR扩增体系为如下表1：表1为PCR反应体系的组成(25μL)上述PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，65℃退火55s，每个循环降低1℃，72℃延伸90s，10个循环；94℃变性30s，55℃退火55s，72℃延伸90s，36个循环；最后72℃7min。得到850bp左右的PCR扩增产物。将850bp左右的PCR扩增产物送去测序，测序引物为728F和Efjr；引物序列为：Efjr:5'-TGYTCNCGRGTYTGNCCRTCYTT-3'。该PCR产物具有序列表中序列3所示的核苷酸，其中序列3第1-20位为上游引物728F，序列3第375-397位为下游引物Efjr的反向互补序列，该序列所示的片段或序列3第21-374为杏鲍菇菌种鉴别DNA条形码片段。杏鲍菇菌种鉴别DNA条形码片段可用于鉴别杏鲍菇菌种，具体方法如下：检测待测样品的基因组中是否含有杏鲍菇标准鉴别DNA条形码片段或含有与其同源性在99％以上的片段，若含有，则待测样品是杏鲍菇菌种，若不含有，则待测样品不是杏鲍菇菌种。实施例2、鉴别杏鲍菇菌种1、本专利技术方法特异性检测分别提取已知品种的杏鲍菇菌种、鲍鱼菇(Pleurotus abalonus)菌种的基因组DNA。以各品种的基因组DNA作为模板，用上述引物728F和1567R扩增，得到各品种的PCR产物。将各品种的PCR产物送去测序，结果如下:已知品种的杏鲍菇菌种的PCR产物的核苷酸序列为序列3(杏鲍菇鉴别DNA条形码片段)。已知品种的鲍鱼菇菌种的PCR产物的核苷酸序列为序列4(序列4第1-20位为上游引物728F，序列4第385-407位为下游引物Efjr的反向互补序列)；已知品种的杏鲍菇菌种用本专利技术方法也鉴别为杏鲍菇菌种；已知品种的鲍鱼菇菌种的PCR产物的序列4第21-384位核苷酸与杏鲍菇菌种鉴别DNA条形码片段序列3第21-374位核苷酸进行比对，同源性为75.4％，已知品种的鲍鱼菇菌种用本专利技术方法鉴别不为杏鲍菇菌种。2、ITS鉴定与本专利技术方法比较分别提取杏鲍菇菌种与鲍鱼菇菌种的基因组DNA。以各品种的基因组DNA作为模板，用上述引物ITS1和引物ITS4扩增，得到各品种的PCR产物。ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’上述PCR扩增体系为表2：表2PCR反应体系的组成(25μL)上述PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种DNA片段，为如下1)或2)或3)：1)、序列3所示的DNA片段；2)、序列3第21‑374位核苷酸所示的DNA片段；3)、为与1)或2)所示片段的核苷酸序列同源性大于99％的片段。

【技术特征摘要】
1.一种DNA片段，为如下1)或2)或3)：1)、序列3所示的DNA片段；2)、序列3第21-374位核苷酸所示的DNA片段；3)、为与1)或2)所示片段的核苷酸序列同源性大于99％的片段。2.权利要求1所述的DNA片段在鉴别或辅助鉴别杏鲍菇菌种中的应用。3.检测杏鲍菇菌种基因组中是否含有权利要求1所述DNA片段的物质在鉴别杏鲍菇菌种中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于:所述物质为如下1)或2)：1)用于扩增所述DNA片段的引物对；2)含有所述引物对的PCR试剂或试剂盒。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于:所述引物对由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成；或所述PCR试剂中，所述引物1和所述引物2的摩尔比为1:1；或所述PCR试剂中，所述引物1和所述引物2的浓度均为10μmol/L。6.一种鉴别或辅助鉴别杏鲍菇菌种的方法，包括如下步骤：检测待测样品中是否含有权利要求1所述DNA片段；如果含有，则待测样品为或候选为杏鲍菇菌种；如果不含有，则待测样品不为或候选不为杏鲍菇菌种。7....

【专利技术属性】
技术研发人员：赵鹏，纪森鹏，周军辉，高兴喜，
申请(专利权)人：鲁东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37