杏鲍菇复合群EST-SSR分子标记特异引物体系及其应用制造技术

本发明专利技术公开了杏鲍菇复合群EST-SSR分子标记特异引物体系，它是采用5对分子标记特异引物，在检测过程中同时使用，在30个杏鲍菇复合群菌种中有多态性，在30个杏鲍菇复合群中进行的遗传多样性分析与侧耳属白灵菇、杏鲍菇和阿魏菇的分类常识相吻合，是稳定存在的新标记，可以直接将本发明专利技术所提供的5对引物对应用于更多杏鲍菇复合群上，进行种质资源和遗传多样性分析，5对分子标记特异引物均来自于杏鲍菇复合群发育相关基因EST序列，为克隆杏鲍菇复合群发育相关基因、基因序列分析奠定了良好的基础，并且大大缩短了分析周期，提高研究效率，对食用菌分子标记选择育种的发展具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学
，具体涉及杏鲍菇复合群EST-SSR分子标记特异引物体系及其在鉴别杏鲍菇复合群的不同菌株的用途。技术背景杏鲍菇（Pleurotuseryngii），又名刺芹侧耳，因其具有杏仁的香味和菌肉肥厚如鲍鱼的口感而得名。是近年来开发栽培成功的及食用、药用、食疗于一体的珍稀食用菌新品种。阿魏菇（Pleurotusferulae）又名阿魏侧耳、阿魏蘑，属担子菌亚门层菌纲伞菌目侧耳科侧耳属，是干旱草原上具有代表性的蕈菌。由于其子实体脆嫩可口，香味浓郁，有草原牛肝菌的美称；又因其具有消积、杀虫、治疗肉积、痞块、久疟、疳劳等药效，当地群众誉之为天山神菇和西天白灵芝。白灵菇(Pleurotuseryngiisubsp.tuoliensis)是白灵侧耳的商品名称，隶属于真菌门、担子菌亚门、真菌纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属，是近年来逐渐发展起来的食用菌新秀之一。杏鲍菇、白灵菇、阿魏菇形态相似，且遗传关系尚不明确。有研究人员认为，阿魏蘑与白灵菇为刺芹侧耳种下的2个变种，但也有人认为，这三者分别为不同的种。白灵菇与阿魏蘑在外观和口感上均很接近，人们易将两者混淆。但实际上它们是亲缘关系非常近的两个种。利用PCR产物克隆测序测定了阿魏菇、白灵菇与杏鲍菇rDNA内转录间隔区(ITS)的序列，测序比对结果表明，阿魏蘑、白灵菇和杏鲍菇三者之间亲缘关系较近，其中白灵菇与杏鲍菇具有非常近的亲缘关系,但阿魏蘑、白灵菇和杏鲍菇为3个不同的种。因此，本专利技术中暂称三个菌种为杏鲍菇复合群。食用菌最早是采用形态学特征为分类依据，虽然形态特征能在一定程度上进行很好的类群的划分，但子实体的形态特征易受外界环境条件的影响，因而很不稳定。因此，形态鉴别不能准确反映被鉴定物种的分类地位。除了形态学分类外，还有利用拮抗试验、同工酶分析来进行菌株的鉴定，但是他们都各自有一些缺点，受影响的因素很多，还需要辅助其他试验才能将菌株鉴别清楚。近年来，随着分子生物学和生物技术的迅速发展，遗传标记技术也得到了迅猛的发展。目前，用于作物种质资源鉴定的分子标记主要有RFLP、RAPD、AFLP、SSR等，但对于核心种质构建、基因性状鉴定、品种指纹图谱建库等研究，SSR分子标记是公认的最佳方法。开发SSR标记主要有构建与筛选基因组文库法、微卫星富集法、省略筛库法和数据库搜索法等。其中数据库搜索法,尤其是从表达序列标签(EST)数据库中搜索，开发EST-SSR标记，已经成为一种广为采用的方法。EST-SSR标记相对于基因组SSR标记而言，由于其来自于转录谱，能够反映出转录区的差异，使EST-SSR标记可以直接与目标性状(如高产或多抗)相联系，在分子标记辅助选择上具有更高的应用价值。针对食用菌的SSR分子标记引物系统比较少，目前国内外还没有针对杏鲍菇复合群鉴定的专用EST-SSR分子标记特异引物，因此本专利技术对于杏鲍菇、白灵菇、阿魏菇及其复合群的资源鉴定和开发利用具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供杏鲍菇复合群EST-SSR分子标记特异引物体系及其应用。杏鲍菇复合群EST-SSR分子标记特异引物体系，它包括：引物1、2、3、4和\\或5；引物1：AAGAGACCGCAAACGAAATGCAAGGCGGGTGGTCTTAGTA引物2：GAAAGCTCGCCATCAGACTCAGAAGAAGCCCGAAGAGAGC引物3：ATCGGATTCGTTGTCGGTAGCGGATTCCTCCTCTTCTTCC引物4：ATCTCACGTTGAGCAGGTCCACCTATCACGAGCCGCATAC引物5：TCCTCTATCTCGCCCATCACGGGACAGCCTATTCGAGGAT杏鲍菇复合群的不同菌株鉴定方法，它包括：1）提取杏鲍菇复合群菌种的基因组DNA；2）以基因组DNA为模板，用上述引物体系进行扩增；3）sequi-GenGT核酸电泳系统上进行聚丙烯酰胺电泳分离，照相后统计条带，转换成0-1数值，利用软件SPSS10.0进行聚类分析。本专利技术提供了杏鲍菇复合群EST-SSR分子标记特异引物体系，它是采用5对分子标记特异引物，在检测过程中同时使用，在30个杏鲍菇复合群菌种中有多态性，在30个杏鲍菇复合群中进行的遗传多样性分析与侧耳属白灵菇、杏鲍菇和阿魏菇的分类常识相吻合（图1），是稳定存在的新标记，可以直接将本专利技术所提供的5对引物对应用于更多杏鲍菇复合群上，进行种质资源和遗传多样性分析；5对分子标记特异引物均来自于杏鲍菇复合群发育相关基因EST序列，为克隆杏鲍菇复合群发育相关基因、基因序列分析奠定了良好的基础。附图说明图1为基于5对SSR位点数据构建的30份杏鲍菇复合群UPGMA聚类图。图中的品种或种名后的字母代表杏鲍菇复合群菌种的类型。具体实施方式一、提取DNA（1）配制DNA提取缓冲液：2%CTAB，0.1MTris，20mMEDTA，1.4MNaCl，pH8.0和DNA溶解缓冲液TE：10MmTris；1MmEDTA；PH=8.0。（2）对上述30个杏鲍菇复合群菌株材料进行如下处理：1)吸取5mlCTAB提取缓冲液置于65℃水浴锅中预热,加0.1gPVP(去除酚类物质)。2)分别称取0.1g不同的杏鲍菇复合群菌株的菌丝体放入研钵中，于液氮中迅速研磨成粉并转入65℃预热的DNA提取液中，颠倒离心管5-10次。(不要剧烈振荡，防止DNA断裂)并放入65℃水浴中30min，期间轻轻颠倒摇动几次。3)4℃，10000rpm离心5min，吸取上清液并加其等体积氯仿/异戊醇(24：1)轻轻混匀，10000rpm离心10min。4)取上清液，用等体积苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)反复抽提。5)加入1/10体积NaAc(3mol/L，pH5.2)和2倍体积冷乙醇，轻轻颠倒离心管几次后置于-20℃冰箱中2h来沉淀DNA。6)取出于4℃，10000rpm离心10min。7)用70%乙醇洗涤沉淀。在超净工作台上将沉淀吹干。8)加100μlTE缓冲液回溶DNA沉淀，同时加入2μlRNase，置37℃处理1h。9)转入1.5ml离心管中，将总体系扩大后加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)和氯仿/异戊醇(24:1)分别抽提。10)吸取上清，重新沉淀DNA，用70%乙醇洗，吹干。11)加入100μl的TE或去离子水回溶。取1-2μl样品与1%的琼脂糖凝胶上电泳，检查样品DNA的质量。（3）将杏鲍菇、白灵菇、阿魏菇不同发育时期的材料进行转录组测序分析，筛选得到40对EST-SSR引物，具体见表2。以步骤（2）提取的待鉴定样品总DNA为模板DNA，以筛选后得到40对特异引物为检测体系引物：EST-SSR标记引物1-40，进行PCR扩增，PCR采用20μl反应体系：在20μl反应本文档来自技高网...

【技术保护点】
杏鲍菇复合群EST‑SSR分子标记特异引物体系，它包括：引物1、2、3、4和\或5；引物1：AAGAGACCGCAAACGAAATG；        CAAGGCGGGTGGTCTTAGTA；引物2：GAAAGCTCGCCATCAGACTC；        AGAAGAAGCCCGAAGAGAGC；引物3：ATCGGATTCGTTGTCGGTAG；        CGGATTCCTCCTCTTCTTCC；引物4：ATCTCACGTTGAGCAGGTCC；       ACCTATCACGAGCCGCATAC；引物5：TCCTCTATCTCGCCCATCAC；       GGGACAGCCTATTCGAGGAT。

【技术特征摘要】
1.杏鲍菇复合群EST-SSR分子标记特异引物体系，它包括：引物1、2、3、4和\\或5；
引物1：AAGAGACCGCAAACGAAATG；
CAAGGCGGGTGGTCTTAGTA；
引物2：GAAAGCTCGCCATCAGACTC；
AGAAGAAGCCCGAAGAGAGC；
引物3：ATCGGATTCGTTGTCGGTAG；
CGGATTCCTCCTCTTCTTCC；
引物4：ATCTCACGTTGAGCAGGTCC；
...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋冰，付永平，李玉，苏文英，代月婷，郭昱秀，王新新，段明政，李丹，李长田，杜鹃，杨洋，刘源，
申请(专利权)人：吉林农业大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22