一种检测尿路感染致病菌的基因芯片试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术提供了一种检测尿路感染致病菌的基因芯片试剂盒及其检测方法。所述包括用于检测的基因芯片和检测体系，其中，所述基因芯片包括工作电极、参比电极和辅助电极，所述工作电极上标记有捕获探针；所述检测体系包括相互独立的DNA提取液、PCR扩增反应液、PCR产物酶液、杂交液、检测液、空白对照、阳性质控品和阴性质控品。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，尤其涉及一种检测尿路感染致病菌的基因芯片试剂盒及其检测方法。
技术介绍
尿路感染又称泌尿系感染，是病原微生物引起的肾脏、输尿管、膀胱和尿道等泌尿系统各个部位感染的总称。尿路感染是常见的感染性疾病，全世界每年发生尿路感染近1.5亿人次，40％～50％女性一生中发生过尿路感染。在我国发生的院内感染中9.4％～50％来自尿路感染。严重的尿路感染，如复杂性尿路感染和肾盂肾炎易引起脓毒症，甚至引起感染性休克。目前我国临床检测方法仍以尿培养为主，但由于其送检周期长，各医院实验室水平、能力不足、检测结果和临床一致性不高等缺陷，导致临床医生的送检意识较为淡薄，很多情况下的诊疗多停留在经验用药的层面上，而非基于病原诊断的基础上，此种用药模式一定程度上导致了抗菌药物的不合理使用，导致了细菌变异事态愈发严峻，继而对抗菌药物耐药的菌株大幅增加和散播。据统计，亚太地区2012年社区获得性单纯性尿路感染对喹诺酮类药物耐药性最高可达69％，复杂性尿路感染高达98％；2011年我国12家医院多中心调查发现来自尿液的大肠埃希菌对喹诺酮和第三代头孢菌素的耐药率分别为49.4％和57.5％。快速的临床微生物诊断方法可对感染性疾病做出快速、准确的病原学诊断确诊依据，为临床医生提供治疗、预防建议和咨询服务；同时可检测和预警感染的爆发，确定爆发的来源并及时控制其播散、提供药敏检测数据，为临床经验用药提供指导。因此，亟待开发一种能够快速、准确做出病原学诊断的检测手段。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测尿路感染致病菌的基因芯片试剂盒，旨在解决现有尿路感染致病菌的检测存在的上述一些列问题。本专利技术的另一目的在于提供一种检测尿路感染致病菌的方法。本专利技术是这样实现的，一种检测尿路感染致病菌的基因芯片试剂盒，包括用于检测的基因芯片和检测体系，其中，所述基因芯片包括工作电极、参比电极和辅助电极，所述工作电极上标记有捕获探针；所述检测体系包括相互独立的DNA提取液、PCR扩增反应液、PCR产物酶液、杂交液、检测液、空白对照、阳性质控品和阴性质控品。以及，一种检测尿路感染致病菌的方法，采用上述检测尿路感染致病菌的基因芯片试剂盒进行检测，检测方法包括以下步骤：提供待检离体尿液样品，采用所述DNA提取液进行提取，获得样本DNA；将所述样本DNA加入PCR反应液中，进行PCR扩增获得扩增产物，同时设置平行的阴性对照、阳性对照和空白对照；将所述扩增产物加入PCR产物酶中进行酶解；将所述杂交液加入到酶解后的所述PCR产物中混合处理得到混合液，将所述混合液滴加到基因芯片工作电极上进行孵育；检测所述基因芯片的电极信号。本专利技术提供的检测尿路感染致病菌的基因芯片试剂盒，可同时适用于尿液样品中大肠埃希菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、无乳链球菌、屎肠球菌、奇异变形杆菌、表皮葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、咽峡炎链球菌、溶血葡萄球菌、摩氏摩根菌、金黄色葡萄球菌、阴沟肠杆菌、克氏柠檬酸杆菌、鲁氏不动杆菌、粘质沙雷菌、产气肠杆菌、恶臭假单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌的快速检测，且准确性高，对于检测和预警感染的爆发，确定爆发的来源并及时控制其播散、提供药敏检测数据，为临床经验用药具有积极的指导意义。此外，本专利技术提供的检测尿路感染致病菌的基因芯片试剂盒，检测灵敏度高，特异性好，可用于实现尿路感染致病菌的高通量快速诊断。本专利技术提供的检测尿路感染致病菌的方法，通过一对16s rRNA基因的通用寡核苷酸的特异性引物进行定性PCR扩增，获得多重16s rRNA基因的扩增产物；通过固定在工作电极表面的特异性捕获探针来捕获PCR多重扩增产物；特异性捕获探针与PCR产物特异性结合，再与其各自的特异性信号探针结合，进而通过电化学交流伏安法(ACV)的检测产生电流变化，通过比较电流值，从而达到快速检测靶多核苷酸的目的，进而推断尿样中致病微生物的种类，为临床用药提供指导。附图说明图1是本专利技术实施例提供的检测尿路感染致病菌的基因芯片试剂盒的基因芯片阵列示意图；图2是本专利技术实施例提供的基因芯片杂交的空白对照检测结果图；图3是本专利技术实施例提供的基因芯片杂交的阳性样本检测结果图；图4是本专利技术实施例提供的基因芯片杂交的阴性质控品检测结果图；图5是本专利技术实施例提供的基因芯片杂交的阳性质控品检测结果图。具体实施方式为了使本专利技术要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术实施例提供了一种检测尿路感染致病菌的基因芯片试剂盒，包括用于检测的基因芯片和检测体系，其中，所述基因芯片包括工作电极、参比电极和辅助电极，所述工作电极上标记有捕获探针；所述检测体系包括相互独立的DNA提取液、PCR扩增反应液、PCR产物酶液、杂交液、检测液、空白对照、阳性质控品和阴性质控品。本专利技术实施例中，所述基因芯片是检测试剂盒的关键组成部分，用于捕获经过PCR扩增、酶解并标记有信号标记物的待测基因液中的特异性基因，进而通过检测杂交后基因芯片的电化学信号、判别待测样品中是否含有对应的尿路感染致病菌。具体的，结合附图1，所述基因芯片包括固相载体和固定在所述固相载体上的电极，所述电极包括工作电极(W)、参比电极(R)和辅助电极(C)，其中，所述工作电极上标记有寡核苷酸探针即捕获探针(圆所示部分)。本专利技术实施例中，所述参比电极和辅助电极均设置一个。所述工作电极可根据待检测样本中可能出现的、或需要检测的不同致病菌的数目进行调控。本专利技术实施例所述检测尿路感染致病菌的基因芯片试剂盒可用于尿液样品中大肠埃希菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、无乳链球菌、屎肠球菌、奇异变形杆菌、表皮葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、咽峡炎链球菌、溶血葡萄球菌、摩氏摩根菌、金黄色葡萄球菌、阴沟肠杆菌、克氏柠檬酸杆菌、鲁氏不动杆菌、粘质沙雷菌、产气肠杆菌、恶臭假单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌20种样品中的至少一种的检测，也可同时用于上述样品的检测。因此，作为优选实施例，本专利技术实施例所述基因芯片包括4个以上工作电极，当所述工作电极为4个时，依次为标记有阳性对照捕获探针、阴性对照捕获探针、空白对照捕获探针和上述一种病原菌捕获探针的工作电极。当然，所述工作电极的数量可进行调整。进一步优选的，为了获得更加清晰可靠的检测结果，每种所述捕获探针均分别标记在2个工作电极上，即形成两组平行测试。更进一步优选的，所述工作电极的数量4-40个。作为具体优选实施例，所述工作电极的数量40个，分别包括下述20种捕获探针标记的工作电极各2个，如附图1所示，40个工作电极依次编号为W1-W40。作为具体实施例，所述捕获探针包括大肠埃希菌捕获探针、粪肠球菌捕获探针、铜绿假单胞菌捕获探针、肺炎克雷伯菌捕获探针、无乳链球菌捕获探针、屎肠球菌捕获探针、奇异变形杆菌捕获探针、表皮葡萄球菌捕获探针、鲍曼不动杆菌捕获探针、咽峡炎链球菌捕获探针、溶血葡萄球菌捕获探针、摩氏摩根菌捕获探针、金黄色葡萄球菌捕获探针、阴沟肠杆菌捕获探针、克氏柠檬酸杆菌捕获探针、鲁氏不动杆菌捕获探针、粘质沙雷菌捕获探针、产气肠杆菌捕获探针、恶臭假单胞菌捕获探针、弗氏柠檬酸杆菌捕获探针中的至少一种和阳性对照捕获探针本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测尿路感染致病菌的基因芯片试剂盒，其特征在于，包括用于检测的基因芯片和检测体系，其中，所述基因芯片包括工作电极、参比电极和辅助电极，所述工作电极上标记有捕获探针；所述检测体系包括相互独立的DNA提取液、PCR扩增反应液、PCR产物酶液、杂交液、检测液、空白对照、阳性质控品和阴性质控品。

【技术特征摘要】
1.一种检测尿路感染致病菌的基因芯片试剂盒，其特征在于，包括用于检测的基因芯片和检测体系，其中，所述基因芯片包括工作电极、参比电极和辅助电极，所述工作电极上标记有捕获探针；所述检测体系包括相互独立的DNA提取液、PCR扩增反应液、PCR产物酶液、杂交液、检测液、空白对照、阳性质控品和阴性质控品。2.如权利要求1所述的检测尿路感染致病菌的基因芯片试剂盒，其特征在于，所述基因芯片包括4个以上工作电极，所述工作电极上分别标记有捕获探针，所述捕获探针包括大肠埃希菌捕获探针、粪肠球菌捕获探针、铜绿假单胞菌捕获探针、肺炎克雷伯菌捕获探针、无乳链球菌捕获探针、屎肠球菌捕获探针、奇异变形杆菌捕获探针、表皮葡萄球菌捕获探针、鲍曼不动杆菌捕获探针、咽峡炎链球菌捕获探针、溶血葡萄球菌捕获探针、摩氏摩根菌捕获探针、金黄色葡萄球菌捕获探针、阴沟肠杆菌捕获探针、克氏柠檬酸杆菌捕获探针、鲁氏不动杆菌捕获探针、粘质沙雷菌捕获探针、产气肠杆菌捕获探针、恶臭假单胞菌捕获探针、弗氏柠檬酸杆菌捕获探针中的至少一种和阳性对照捕获探针、阴性对照捕获探针、空白对照捕获探针，且各捕获探针的序列如下所示：大肠杆菌捕获探针CP1：5’-TGAGCAAAGGTATTAACTTTACTCC-3’；粪肠球菌捕获探针CP2：5’-TGAGCAAAGGTATTAACTTTACTCC-3’；铜绿假单胞菌捕获探针CP3：5’-TGAGCAAAGGTATTAACTTTACTCC-3’；肺炎克雷伯菌捕获探针CP4：5’-TCGATGAGGTTATTAACCTTACG-3’；无乳链球菌捕获探针CP5：5’-CACAGTGAAGCAATTGCTCCTTTTA-3’；屎肠球菌捕获探针CP6：5’-AAGGGATGAACAGTTACTCTCATC-3’；奇异变形杆菌捕获探针CP7：5’-TTCATCCGATAGTGCAAGGTCCGAA-3’；咽峡炎链球菌捕获探针CP8：5’-CTACTAGCGATGCAATTGCATCTTTC-3’；结核杆菌捕获探针CP9：5’-GGTCCTATCCGGTATTAGACCCAGTTTCCCAG-3’；奴卡菌捕获探针CP10：5’-GAGATACAGGGTCATTTAGTTGGTGGGT-3’；粪肠球菌、屎肠球菌捕获探针CP11：5’-AAACAGCAAGGTATTAACTTACT-3’；铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌捕获探针CP12：5’-GGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGA-3’；无乳链球菌、咽峡炎链球菌捕获探针CP13：5’-CGAGTCGCAAGCCGGTGACGGCA-3’；表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、金黄色葡萄球菌捕获探针CP14：5’-AAGACGTGCATAGTTACTTACACATATGTTC-3’；鲍曼不动杆菌、鲁氏不动杆菌捕获探针CP15：5’-ATCCCTTTCGAGATGTTGTCCC-3’；肠杆菌通检捕获探针CP16：5’-AGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAA-3’；细菌通检捕获探针CP17：5’-GATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTG-3’；阳性对照捕获探针CP18：5’-TGAGCAAAGGTATTAACTTTACTCC-3’；阴性对照捕获探针CP19：5’-TGAGCAAAGGTATTAACTTTACTCC-3’；空白对照捕获探针CP20：5’-TGAGCAAAGGTATTAACTTTACTCC-3’。3.如权利要求2所述的检测尿路感染致病菌的基因芯片试剂盒，其特征在于，所述工作电极、参比电极和辅助电极均为金电极，所述捕获探针的3’段均有巯基修饰。4.如权利要求2或3所述的检测尿路感染致病菌的基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：李颖，肖婧，胡晓艳，于洪宇，吴宇亮，陈汗英，
申请(专利权)人：北京大学深圳医院，南方科技大学，
类型：发明
国别省市：广东;44