一种恒温扩增反应试剂制造技术

本发明专利技术公开了一种针对长双链DNA的恒温扩增反应试剂，其使用的恒温扩增反应以水为溶剂，添加有Tris–HCl、MgCl2、KCl、DMSO、NTPs、dNTPs、DTT、Na4P2O7、Na2HPO4、NaH2PO4以及限制性内切酶、T4 DNA连接酶、AMV逆转录酶、T7 RNA聚合酶、RNase H酶，各适量。本发明专利技术的恒温扩增体系相对于现有的恒温扩增体系，主要针对长度大于500 bp的双链DNA，甚至于可适用于长度大于2000 bp的双链DNA，应用范围更广。

Constant temperature amplification reaction reagent

The invention discloses a constant temperature for long double stranded DNA amplification reaction reagent, the use of the isothermal amplification reaction with water as solvent, adding Tris - HCl, MgCl2, KCl, DMSO, NTPs, dNTPs, DTT, Na4P2O7, Na2HPO4, NaH2PO4, T4 and restriction endonuclease DNA ligase, AMV reverse transcriptase T7, RNA, RNase polymerase H enzyme, the amount of. The constant temperature amplification system with respect to the existing constant temperature amplification system, mainly for double stranded DNA length is greater than 500 BP, even for double stranded DNA in length is greater than 2000 BP, wide application range.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种核酸恒温扩增
，特别涉及模板长度大于500bp的双链DNA分子的恒温扩增

技术介绍
1983年，Mullis等专利技术了聚合酶链式反应（PCR）技术，由于其在灵敏度和特异性方面的优势，被迅速运用于科学研究和临床研究的各个方面。这种技术主要依赖于与靶序列两段互补的寡核苷酸引物，利用热循环实现信号放大。反应主要包括模板高温变形、引物和模板退火、引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，经过多次循环反应，使得低浓度的靶标可以被扩增到可检测的水平。这一技术极大地促进了生物研究的进展。PCR技术在应用上的几点限制：第一，该技术需要昂贵的实验仪器，同时该机器需要具备精确的控温程序，以保证模板链在高温下变形，保证模板链与引物在较低温度下退火，同时重复高温、冷却、保温等步骤。为了保证仪器在短时间内完成温度变化，需要配备银制或者金制的加热模块，仪器成本显著增加。第二，扩增体系中的酶必须耐受高温，否则每次进入新循环时需要补加酶，容易造成污染。第三，在扩增反应中，退火时间短，必须有过量的引物才能使引物与模板上相应的序列快速配对。但是过量的引物会与模板错配，引发非特异性扩增，引物二聚体等问题。1991年Compton等专利技术了依赖于核酸序列的扩增技术（NASBA），该技术是一种基于转录的扩增技术，反应温度为37-41ºC。反应涉及三种酶：T7RNA聚合酶（对T7启动子序列具有高度特异性，以含有T7启动子序列的双链DNA为模板，合成与启动子下游的DNA互补的RNA），AMV反转录酶（以RNA为模板合成DNA，以DNA为模板合成DNA），RNaseH酶（降解DNA/RNA杂合分子中的RNA链）。反应涉及两条引物：正向引物5′端是T7启动子序列，3′端序列与靶标DNA3′端序列互补；反向引物与cDNA的3′端序列互补。过程如下：正向引物结合到靶标DNA上，在AMV逆转录酶作用下延伸，反向引物结合到正向引物延伸后形成的DNA上，以正向引物延伸后形成的DNA为模板进行延伸，由于正向引物5′端含有T7启动子序列，因此反向引物延伸到此位置后便形成双链T7启动子。T7RNA聚合酶识别T7启动子，并以启动子下游的DNA为模板转录合成RNA，由此，NASBA进入了循环扩增模式，得到大量RNA扩增子。NASBA技术的特点：第一，该技术是恒温扩增反应，反应温度为37-41ºC，不需要使用精密的温度循环仪器。第二，扩增反应涉及AMV逆转录酶，适合RNA模板。第三，扩增的产物是单链RNA。第四，反应需要三种酶协同作用。第五，靶标长度限定在100-250个碱基。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对长度大于500bp的双链DNA进行恒温扩增。本专利技术采用的技术方案是：一种恒温扩增反应试剂，溶剂为水，其组成如下：上述反应试剂所用的Tris–HCl的pH为8.5。进一步的，本专利技术还提出一种连接反应试剂，溶剂为水，其组成如下：上述反应试剂所用的Tris–HCl的pH为7.9。上述连接反应将T7序列与剪切后的模板连接。本专利技术又提出一种长双链模板的剪切方法，包括根据序列选择限制性内切酶对模板剪切，不同的限制性内切酶采用不用的缓冲液体系，剪切后将体系的酶灭活，完成剪切反应。恒温扩增反应结束后用凝胶电泳对反应产物进行检测。恒温扩增引物需要根据不同的序列进行不同的设计。一种核酸恒温扩增方法，包括将引物、模板与扩增反应试剂混合，恒温扩增至预期量后，完成恒温扩增。作为上述反应试剂的进一步改进，恒温扩增的温度为37-41ºC。本专利技术的有益效果是：本专利技术的恒温扩增靶标针对长度大于500bp的双链DNA，甚至于长度大于2000bp的双链DNA，应用范围广。附图说明图1是实施例1的恒温扩增结果；泳道1：模板浓度20nM的反应产物；泳道2：模板浓度10nM的反应产物；泳道3：模板浓度1nM的反应产物；泳道4：阴性对照；M：20bpDNALadderMarker。图2是实施例2的恒温扩增结果；泳道1：含有模板的反应组；泳道2：阴性对照。具体实施方式一种恒温扩增反应试剂，溶剂为水，其组成如下：上述反应试剂所用的Tris–HCl的pH为8.5。上述反应试剂三羟甲基氨基甲烷（Tris）购于捷瑞（上海）生物科技公司。上述反应试剂氯化钾（KCl）、氯化镁（MgCl2）、盐酸（HCl）购于上海林峰精细化工有限公司。上述反应试剂二甲基亚砜（DMSO）购于Sigma-Aldrich公司（SaintLouis，美国）。上述反应试剂T7RNA聚合酶、AMV反转录酶、RNaseH酶、牛血清白蛋白（BSA）购于纽英伦生物技术公司（Nebraska，美国）。上述反应试剂核糖核苷酸（NTP）、RNA酶抑制剂（RNaseinhibitor）购于赛默飞世尔科技有限公司（北京，中国）。上述反应试剂脱氧核糖核苷酸（dNTP）购于生工公司（上海，中国）。一种连接反应试剂，溶剂为水，其组成如下：上述反应试剂所用的Tris–HCl的pH为7.9。上述反应试剂购于宝生物工程有限公司（大连，中国）。扩增反应引物的设计依据为靶标模板的序列。Tris–HCl的作用在于维持一定的pH，以便酶在最适pH下进行扩增反应，其浓度可以根据需要进行相应的调整。KCl的作用在于提供一定的例子浓度，其用量可以根据核酸扩增情况进行一定的调整。T7RNA聚合酶、AMV逆转录酶、RNaseH酶的用量可以根据需要调整。恒温扩增反应后可以用凝胶电泳对反应产物进行检测。一种核酸恒温扩增方法，包括将引物、模板与扩增反应试剂混合，恒温扩增至预期量后，完成恒温扩增。作为上述反应试剂的进一步改进，恒温扩增的温度为37-41ºC。下面结合实施例，进一步说明本专利技术的技术方案。实施例1：一种长双链DNA的剪切反应试剂的具体成分如下：上述反应试剂购于宝生物工程有限公司（大连，中国）。一种连接反应试剂，溶剂为水，其组成如下：上述反应试剂购于宝生物工程有限公司（大连，中国）。一种恒温扩增反应试剂，溶剂为水，其组成如下：上述反应试剂三羟甲基氨基甲烷（Tris）购于捷瑞（上海）生物科技公司。上述反应试剂氯化钾（KCl）、氯化镁（MgCl2）、盐酸（HCl）购于上海林峰精细化工有限公司。上述反应试剂二甲基亚砜（DMSO）购于Sigma-Aldrich公司（SaintLouis，美国）。上述反应试剂T7RNA聚合酶、AMV反转录酶、RNaseH酶、牛血清白蛋白（BSA）购于纽英伦生物技术公司（Nebraska，美国）。上述反应试剂核糖核苷酸（NTP）、RNA酶抑制剂（RNaseinhibitor）购于赛默飞世尔科技有限公司（北京，中国）。上述反应试剂脱氧核糖核苷酸（dNTP）购于生工公司（上海，中国）。实施例2同实施例1，不同之处在于长双链DNA的剪切反应试剂，具体成分如下：上述反应试剂购于宝生物工程有限公司（大连，中国）。下面结合具体的实验，进一步说明本专利技术。鼠伤寒沙门氏菌LT2菌株的invA基因的恒温扩增正向引物：GATCACTAATACGACTCACTATAGGGAATAGAGAAGACAACAAAACCCACC反向引物：GCCGATGCCGGTGAAATTATCG正向T7序列：CGTTCTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种恒温扩增反应试剂，溶剂为水，其组成如下：所述AMV反转录酶是RNA为模板合成DNA，或DNA为模板合成DNA；所述RNase H酶能消化RNA‑DNA杂交双链中的RNA链。

【技术特征摘要】
1.一种恒温扩增反应试剂，溶剂为水，其组成如下：所述AMV反转录酶是RNA为模板合成DNA，或DNA为模板合成DNA；所述RNaseH酶能消化RNA-DNA杂交双链中的RNA链。2.根据权利要求1所述的恒温扩增反应试剂，其特征在于：Tris–HCl的pH为8.5。3.一种核酸恒温扩增方法，包括将引物、模板与恒温扩增反应试剂混合，完成核酸恒温扩增，其中，所述恒温扩增反应试剂为权利要求1所述的恒温扩增反应试剂。4.根据权利要求3所述的一种核酸恒温扩增方法，其特征在于，扩增反应结束后用凝胶电泳对反应产物进行检测。5.根据权利要求3...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶邦策，尹斌成，史杨，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：上海;31