一种电化学核酸适体传感器检测癌胚抗原的方法技术

本发明专利技术公开了一种纳米探针诱导酶聚合放大电化学核酸适体传感器检测癌胚抗原的方法。将5’末端巯基标记的癌胚抗原核酸适体信号探针修饰到金纳米粒子的表面制成纳米探针备用，在金电极表面修饰一层3’末端巯基标记的癌胚抗原核酸适体捕获探针；加入癌胚抗原和纳米探针后，3’端巯基修饰癌胚抗原核酸适体捕获探针、癌胚抗原和5’端巯基修饰癌胚抗原核酸适体信号探针特异性结合，在电极表面得到裸露的3’末端，从而进行末端延伸；然后亲和素标记的辣根过氧化物酶特异性结合到电极表面；检测辣根过氧化物酶催化电解液产生的电化学信号变化实现对癌胚抗原的高灵敏度、高特异性检测，可用于肿瘤的早期诊断、疗效判断、病情发展、监测和预后估计等。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于电化学生物传感器研究领域，涉及一种纳米探针诱导酶聚合放大电化学核酸适体传感器检测癌胚抗原的方法。
技术介绍
一方面癌胚抗原是一种广谱性的肿瘤标记物，在多种肿瘤的疗效判断、病情发展、监测和预后估计中有着重要的作用；另一方面，实际样本中的癌胚抗原含量往往很低，需要研究和设计高灵敏度和高选择性的检测方法来实现癌胚抗原的检测。为了提高癌胚抗原的检测灵敏度和选择性，各种癌胚抗原检测方法也应运而生，在各种检测方法中实现癌胚抗原的特异性识别和信号放大成为研究的重点。在蛋白质的检测中，最常用的识别分子是抗体。但是抗体的制备过程复杂、制备费用高，而且抗体分子要在一定的条件下才能保持活性，影响着检测方法的灵敏度和适用范围。为了解决这一难题，最近几十年出现了一种新的识别分子——核酸适体。核酸适体是一种能够特异性识别靶分子的寡聚核苷酸片段，对可结合的靶分子有严格的识别能力和高度的亲和性，并且其制备过程简单、制备费用较低、存储和使用条件没有抗体严格。核酸适体自被发现以来得到大家广泛研究和应用。在信号放大过程中常用的有核酸扩增技术，纳米材料和酶等。目前常用的核酸扩增技术有聚合酶链式反应和一些等温核酸扩增技术如滚环复制扩增等。聚合酶链式反应技术需要严格控制温度的变化，因而需要比价复杂的反应仪器，成本较高；而滚环复制扩增过程也需要加入反应模版，从而增加了反应体系的复杂程度，增加了成本。为了解决这些问题，一种新的核酸扩增技术表面诱导末端延伸技术应运而生，这种在末端脱氧核糖核酸转移酶催化的无需模版的在核酸3’末端延伸核酸长链的核酸放大技术得到了广泛的应用。纳米材料因为其特有的尺寸性质，在信号放大策略中得到发挥着不可替代的作用。而金纳米粒子有高的表面体积比、制备工艺较成熟、稳定性好、生物相容性好，易于功能化(特别是可以通过金-硫键将核酸修饰在金纳米粒子表面)等优点。酶催化作用能够在引入一个酶分子的情况下催化多个底物的反应而使信号得到放大，也在信号放大策略中扮演着不可忽视的角色。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了高灵敏和高选择性地检测痕量的癌胚抗原，提供一种纳米探针诱导酶聚合放大的电化学核酸适体传感器检测癌胚抗原的方法。实现本专利技术目的的技术解决方案为：一种纳米探针诱导酶聚合放大的电化学核酸适体传感器检测癌胚抗原的方法，包括如下步骤：步骤一、纳米探针的制备：在金纳米粒子溶液中缓慢加入5’末端巯基标记癌胚抗原核酸适体信号探针溶液，反应后陈化，然后离心、洗涤、离心、重悬；步骤二、电化学传感器的制备：(a)金电极的清洗：以NaBH4溶液浸泡后打磨，然后超声清洗；(b)自清洁表面的制备：室温下在金电极表面自组装3’末端标记巯基的癌胚抗原核酸适体捕获探针溶液，然后用OEG室温下浸泡封闭，得到自清洁表面；(c)纳米探针的修饰：在自清洁表面滴加癌胚抗原溶液反应不少于1小时，滴加纳米探针溶液反应不少于1小时；(d)末端延伸：在末端脱氧核糖核酸转移酶的作用下，在步骤(c)修饰到金电极表面的5’端巯基标记癌胚抗原核酸适体信号探针的3’端延伸生物素标记的核酸长链，加入亲和素标记的辣根过氧化物酶反应不少于15min，通过生物素-亲和素相互作用，在电极表面修饰辣根过氧化物酶，制得电化学传感器；步骤三、电化学信号检测：将制备完成的电化学传感器放在三电极体系中以循环伏安法和时间电流曲线法进行检测，得到电化学信号。步骤一中，采用的重悬溶剂为含有1wt％吐温的PBS溶液，其中金纳米粒子的粒径为30nm，其溶液浓度为1nmol/L；5’末端巯基标记癌胚抗原核酸适体信号探针的溶液浓度为0.5-15μmol/L。步骤二(b)中，3’端巯基标记癌胚抗原捕获探针的浓度为0.5-5μmol/L，自组装时间不小于4小时；HS-(CH2)11-EG2-OH(OEG)浓度为0.5-2.5mmol/L，浸泡时间不小于4小时。步骤二(d)中，末端脱氧核糖核酸转移酶的浓度为1U，生物素标记的核苷酸为生物素标记的腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，浓度为5.7μmol/L，延伸时间不小于1小时。步骤三中，电化学检测体系为三电极体系，工作电极为金电极，参比电极为Ag/AgCl电极，对电极为铂丝电极，其中，电解液为3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液(TMB)，循环伏安法扫描高电位为0.7V，低电位为0V，扫描速度为0.1V/s；时间电流曲线法的扫描电位为0.1V，扫描时间为100s。步骤一和二中，所述核酸适体序列如下：所述的5’末端巯基标记癌胚抗原核酸适体信号探针序列为：5’-SH-TTTTTTTTTTCCCATAGGGAAGTGGGGGA-3’；所述的3’末端巯基标记癌胚抗原核酸适体捕获探针序列为：5’-TTAACTTATTCGACCATATTTTTTTTTT-SH-3’。本专利技术与现有技术相比，具有以下特点：1、检测灵敏度高：本专利技术对癌胚抗原的检测下限低于10fg/ml，在现有的癌胚抗原检测传感器中处于较高的灵敏度水平。2、检测的范围宽：本专利技术对DNA的检测范围宽度大于8个数量级，在现有的癌胚抗原传感器中处于较宽的检测宽度。3、检测体系简单：本专利技术使用的检测方法为简单的电化学检测，对样本的颜色没有要求，灵敏度高，并且易于简单化和微型化。4、实际应用性强：本专利技术的癌胚抗原传感器在模拟的血清样本中仍然具有较高的检测信号，说明本传感器在实际样本中的应用性强，有很高的临床诊断方面应用前景。附图说明图1是本专利技术纳米探针诱导的酶聚合放大电化学核酸适体传感器检测癌胚抗原方法的过程示意图。图2是本专利技术实施例1的纳米探针吸光度曲线，其中，A中a为未修饰5’端巯基标记癌胚抗原核酸适体信号探针的吸光度曲线，b为修饰5’端巯基标记癌胚抗原核酸适体信号探针的吸光度曲线；B中，c为纳米金加了氯化钠后的吸光度曲线，d为纳米探针加氯化钠的吸光度曲线。图3是本专利技术实施例2-4中的条件优化结果图，其中A为实施例2，B为实施例3，C为实施例4。图4是本专利技术实施例5中的对不同浓度癌胚抗原的检测电流图。图5是本专利技术实施例6中的相同浓度下前列腺特异性抗原、小牛血清白蛋白和癌胚抗原的检测电流对比图。图6是本专利技术实施例7中在缓冲溶液和血清中相同浓度癌胚抗原检测电流对比图。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术作进一步的说明，其目的是为了更好理解本专利技术的内容，但所举的实施例并不限制本专利技术的保护范围：如附图1中所示的步骤，搭建纳米探针诱导酶聚合放大电化学核酸适体传感器体系，并进行电化学检测。(1)电化学传感器检测癌胚抗原体系的建立a、金电极清洗：1)NaBH4溶液浸泡(往NaBH4固体中先加入一定体积的无水乙醇，再加入等体积的双蒸水，混匀后将电极浸泡在其中，浸泡15分钟，用双蒸水冲洗掉NaBH4溶液)2)打磨(在磨布上倒上一定量的Al2O3粉末，然后加上少量水，将电极垂直在磨布上打磨3分钟，用超纯水冲洗干净)3)超声清洗(先用乙醇超声清洗4-5分钟，再用双蒸水超声清洗4-5分钟，用双蒸水冲洗)4)电化学扫描(以0.5mol/L的H2SO4为电解液，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极，对金工作电极进行电化学扫描。先进行慢扫，然后加2V电压电解5秒，再加-0.35V电压电解10秒，而后快速扫描2次，清本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种纳米探针诱导酶聚合放大的电化学核酸适体传感器检测癌胚抗原的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一、纳米探针的制备：在金纳米粒子溶液中缓慢加入5’末端巯基标记癌胚抗原核酸适体信号探针溶液，反应后陈化，然后离心、洗涤、离心、重悬；步骤二、电化学传感器的制备：(a)金电极的清洗：以NaBH4溶液浸泡后打磨，然后超声清洗；(b)自清洁表面的制备：室温下在金电极表面自组装3’末端标记巯基的癌胚抗原核酸适体捕获探针溶液，然后用HS‑(CH2)11‑EG2‑OH室温下浸泡封闭，得到自清洁表面；(c)纳米探针的修饰：在自清洁表面滴加癌胚抗原溶液反应不少于1小时，滴加纳米探针溶液反应不少于1小时；(d)末端延伸：在末端脱氧核糖核酸转移酶的作用下，在步骤(c)修饰到金电极表面的5’端巯基标记癌胚抗原核酸适体信号探针的3’端延伸生物素标记的核酸长链，加入亲和素标记的辣根过氧化物酶反应不少于15min，通过生物素‑亲和素相互作用，在电极表面修饰辣根过氧化物酶，制得电化学传感器；步骤三、电化学信号检测：将制备完成的电化学传感器放在三电极体系中以循环伏安法和时间电流曲线法进行检测，得到电化学信号。

【技术特征摘要】
1.一种纳米探针诱导酶聚合放大的电化学核酸适体传感器检测癌胚抗原的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一、纳米探针的制备：在金纳米粒子溶液中缓慢加入5’末端巯基标记癌胚抗原核酸适体信号探针溶液，反应后陈化，然后离心、洗涤、离心、重悬；步骤二、电化学传感器的制备：(a)金电极的清洗：以NaBH4溶液浸泡后打磨，然后超声清洗；(b)自清洁表面的制备：室温下在金电极表面自组装3’末端标记巯基的癌胚抗原核酸适体捕获探针溶液，然后用HS-(CH2)11-EG2-OH室温下浸泡封闭，得到自清洁表面；(c)纳米探针的修饰：在自清洁表面滴加癌胚抗原溶液反应不少于1小时，滴加纳米探针溶液反应不少于1小时；(d)末端延伸：在末端脱氧核糖核酸转移酶的作用下，在步骤(c)修饰到金电极表面的5’端巯基标记癌胚抗原核酸适体信号探针的3’端延伸生物素标记的核酸长链，加入亲和素标记的辣根过氧化物酶反应不少于15min，通过生物素-亲和素相互作用，在电极表面修饰辣根过氧化物酶，制得电化学传感器；步骤三、电化学信号检测：将制备完成的电化学传感器放在三电极体系中以循环伏安法和时间电流曲线法进行检测，得到电化学信号。2.如权利要求1所述的纳米探针诱导酶聚合放大的电化学核酸适体传感器检测癌胚抗原的方法，其特征在于，步骤一中，采用的重悬溶剂为含有1wt％吐温的PBS溶液，其中金纳米粒子的粒径为30nm，其溶液浓度为1nmol/L；5’末端巯基标记癌胚抗原核酸适体信号探针的溶液浓度为0.5-15μmol/L。3.如权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：万莹，王鹏娟，苏岩，杨树林，
申请(专利权)人：南京理工大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32