用于在核酸测定中改善解链分辨和多重性的探针制造技术

提供了用于检测和定量核酸的方法和组合物。在某些实施方案中，方法涉及使用包含在靶核酸分子的存在下对内切核糖核酸酶(例如，RNA酶H)切割易感的核糖核苷酸位置的可切割探针。实施方案的探针还可以包含与报告基团和/或淬灭部分连接的非天然核苷酸。

Probe for improving chain resolution and multiplicity in nucleic acid determination

Methods and compositions for detecting and quantification of nucleic acids are provided. In some embodiments, the method involves the use of a cleavage probe for cleavage of the susceptible nucleotide position of an endonuclease (e.g., RNA, H) in the presence of a target nucleic acid molecule. The probe of the embodiment may also contain a non natural nucleotide linked to the reporter moiety and / or quenching moiety.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于在核酸测定中改善解链分辨和多重性的探针相关申请的交叉引用本申请要求于2014年8月11日提交的美国临时专利申请No62/035,783的权益，其全部内容通过引用并入本文。序列表的并入包含在创建于2015年8月11日的8KB(在中测量)的名为“LUMNP0129WO_ST25.txt”的文件中的序列表通过电子提交的方式与本文一起提交，并通过引用并入。专利技术背景
本专利技术一般性涉及分子生物学领域。更特别地，其涉及核酸的检测。
技术介绍
聚合酶链式反应(PCR)是不采用活的生物体对DNA进行酶促复制的分子生物学技术。PCR通常用于医学和生物研究实验室以承担多种任务，例如遗传疾病的检测、基因指纹的鉴定、感染性疾病的诊断、基因克隆、亲子鉴定和DNA计算。由于其无可比拟的复制和精确能力，PCR被分子生物学家认为是核酸检测的首选方法。通常在PCR反应的终点(end-point)或者平台期进行DNA检测，这使得难以对起始模板进行定量。实时PCR或动态PCR通过记录反应过程中的扩增子浓度，从而提高了终点PCR分析的能力。最通常通过与被扩增的靶标有关的荧光信号的改变来记录扩增子浓度。实时PCR相对于终点检测的优势还在于，由于其在封闭的系统中进行，因此限制了污染。其它优势包括更高的灵敏度、动态范围、速度和需要较少的过程。在实时PCR检测方法中已经采用了几种测定化学。这些测定化学包括采用双链DNA结合染料、双标记的寡核苷酸，例如发夹引物和发夹探针。然而，目前实时PCR的一个缺陷在于其受限的多重性(multiplexing)能力。目前的实时PCR技术采用在溶液中游离的报告荧光染料。在多重反应中，该设计必须在每个测定中采用光谱不同的荧光染料。例如，设计来检测4个靶序列的多重反应将需要能够通过光谱不同来区分4个不同的、游离漂浮的荧光染料的仪器，这还不包括对照。这些要求不仅限制了实际的多重能力，而且增加了成本，其原因在于这样的设备通常需要多个发射源、检测器和滤器。目前的实时PCR技术的多重能力为大约1-6重(plex)。
技术实现思路
本专利技术涉及用于扩增和检测DNA的系统和方法。特别地，本专利技术的实施方案提供了大大提高用于检测经扩增靶序列的可检测探针的多重能力的系统和方法。在第一实施方案中，提供了用于检测靶核酸存在的方法，其包括：(a)使样品与可切割探针接触，所述探针从5’至3’包含(i)包含标记物的第一序列区；(ii)第二序列区；(iii)为第二序列区的反向互补序列(reversecomplement)的序列；和(iv)包含与靶核酸第一链上的第一区互补的一个或更多个核糖核苷酸碱基的序列；(b)使所述可切割探针与内切核糖核酸酶接触，从而切割与靶核酸杂交的探针以形成截短的可切割探针；(c)使所述截短的可切割探针与其自身杂交以形成发夹探针；(d)延伸所述发夹探针；以及(e)通过检测标记物的信号改变来检测所述靶核酸。在某些方面，第一序列区(i)中的标记是报告基团-淬灭基团对，并且第一序列区上发夹探针的延伸改变报告基团和淬灭基团之间的距离；或用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸和第一序列区上发夹探针的延伸导致用报告基团-淬灭基团对的第二成员标记的互补非天然核苷酸的引入。在某些方面，所述为第二序列区的反向互补序列的序列(iii)的全部、一部分可与靶核酸第一链上的第一区互补或序列(iii)不与靶核酸第一链上的第一区互补。在一些实施方案中，所述方法还包括对发夹探针进行解链分析(meltanalysis)。在一个实施方案中，提供了用于检测靶核酸存在的方法，其包括：(a)使样品与可切割探针接触，所述探针从5’至3’包含(i)包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸的第一序列区；(ii)第二序列区；(iii)为第二序列区的反向互补序列的序列；和(iv)包含与靶核酸第一链上的第一区互补的一个或更多个核糖核苷酸碱基的序列；(b)使所述可切割探针与内切核糖核酸酶接触，从而切割与靶核酸杂交的探针以形成截短的可切割探针；(c)使所述截短的可切割探针与其自身杂交以形成发夹探针；(d)在能够与第一序列区的至少一个非天然核苷酸碱基配对的用报告基团-淬灭基团对的第二成员标记的非天然核苷酸的存在下延伸所述发夹探针；以及(e)通过检测可切割探针和发夹探针上标记物的信号改变来检测所述靶核酸。在某些方面，所述为第二序列区的反向互补序列的序列(iii)的一部分可以与靶核酸第一链上的第一区互补。在一些实施方案中，所述方法还包括对发夹探针进行解链分析。在另一个实施方案中，提供了用于检测靶核酸存在的方法，其包括：(a)使样品与可切割探针接触，所述探针从5’至3’包含(i)用报告基团-淬灭基团对标记的第一序列区；(ii)第二序列区；(iii)为第二序列区的反向互补序列的序列；和(iv)包含与靶核酸第一链上的第一区互补的一个或更多个核糖核苷酸碱基的序列；(b)使所述可切割探针与内切核糖核酸酶接触，从而切割与靶核酸杂交的可切割探针以形成截短的探针；(c)使所述所述截短的探针与其自身杂交以形成发夹探针；(d)将所述发夹探针延伸到第一序列区上，以使得报告基团和淬灭基团之间的距离增加；以及(e)通过检测报告基团的信号改变来检测所述靶核酸。在某些实施方案中，所述报告基团-淬灭基团对的成员之一在可切割探针的5’端。在一些实施方案中，所述报告基团-淬灭基团对的成员之一在第一序列区的5’端，而报告基团-淬灭基团对的另一个成员在第一序列区的3’端。在某些实施方案中，所述报告基团是荧光染料。在某些方面，所述为第二序列区的反向互补序列的序列(iii)的全部、一部分可以与靶核酸第一链上的第一区互补或序列(iii)不与靶核酸第一链上的第一区互补。在一些实施方案中，所述方法还包括对发夹探针进行解链分析。在某些方面，所述可切割探针还可以包含(v)在第二序列区和为第二序列区的反向互补序列的序列之间的一个或更多个核苷酸的环序列(loopsequence)。在一些方面，所述环序列的长度可以是4-20、6-15或10-15个核苷酸。在一些方面，所述环序列可以包含至少3-5个连续的A核苷酸。在一些实施方案中，所述环序列包含一个或更多个聚合酶延伸阻断部分。在某些方面，所述环序列可以包含一个或更多个核苷酸和一个或更多个延伸阻断部分的组合。聚合酶延伸阻断部分可以用作所述环序列的一部分或全部。延伸阻断部分的实例包括碳间隔区(spacer)。碳间隔区可以包括长度可以为3至36个碳原子的间隔区。内部寡核苷酸碳间隔区的常见实例包括长度为3、9和18个碳原子的间隔区。碳间隔区可用于阻止可切割探针形成非特异性双链PCR产物。碳间隔区也可以用于调节发夹探针的解链温度(melttemperature，Tm)。其他聚合酶延伸阻断部分可包含非天然核苷酸、核糖核苷酸或任何其他非核苷酸化学部分。在某些方面，所述第二序列区的长度可以是6-20个核苷酸。在某些方面，所述第二序列区互补序列的长度可以是6-20个核苷酸。在某些方面，所述第一序列区的长度可以是4-20个核苷酸。在某些方面，所述与靶核酸第一链上的第一区互补的序列的长度可以是6-50、10-50或6-30个核苷酸。在某些方面，所述可切割探针的一个或更多个本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测靶核酸存在的方法，其包括：(a)使样品与第一可切割探针接触，所述探针从5’至3’包含(i)包含用报告基团‑淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸的第一序列区；(ii)第二序列区；(iii)为所述第二序列区的反向互补序列的序列；和(iv)包含与所述靶核酸第一链上的第一区互补的一个或更多个核糖核苷酸碱基的序列；(b)使所述可切割探针与内切核糖核酸酶接触，从而切割与靶核酸杂交的探针以形成截短的可切割探针；(c)使所述截短的可切割探针与其自身杂交以形成发夹探针；(d)在能够与所述第一序列区的所述至少一个非天然核苷酸碱基配对的用报告基团‑淬灭基团对的第二成员标记的非天然核苷酸的存在下延伸所述发夹探针；以及(e)通过检测所述可切割探针和所述发夹探针上标记物的信号改变来检测所述靶核酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.08.11 US 62/035,7831.用于检测靶核酸存在的方法，其包括：(a)使样品与第一可切割探针接触，所述探针从5’至3’包含(i)包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸的第一序列区；(ii)第二序列区；(iii)为所述第二序列区的反向互补序列的序列；和(iv)包含与所述靶核酸第一链上的第一区互补的一个或更多个核糖核苷酸碱基的序列；(b)使所述可切割探针与内切核糖核酸酶接触，从而切割与靶核酸杂交的探针以形成截短的可切割探针；(c)使所述截短的可切割探针与其自身杂交以形成发夹探针；(d)在能够与所述第一序列区的所述至少一个非天然核苷酸碱基配对的用报告基团-淬灭基团对的第二成员标记的非天然核苷酸的存在下延伸所述发夹探针；以及(e)通过检测所述可切割探针和所述发夹探针上标记物的信号改变来检测所述靶核酸。2.根据权利要求1所述的方法，其中为所述第二序列区(ii)之反向互补序列的序列的一部分与所述靶核酸第一链上的第一区互补。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述内切核糖核酸酶是RNA酶H。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述RNA酶H是RNA酶HII。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述内切核糖核酸酶是热稳定的RNA酶HII。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述内切核糖核酸酶是嗜热的、热启动的RNA酶HII。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述可切割探针还包含(v)在所述第二序列区和为所述第二序列区的反向互补序列的序列之间的一个或更多个核苷酸的环序列。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述环序列的长度为4-20、6-15或10-15个核苷酸。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述环序列包含至少3-5个连续的A核苷酸。10.根据权利要求1所述的方法，其中所述可切割探针包含位于核糖核苷酸碱基3’的延伸阻断修饰。11.根据权利要求7所述的方法，其中所述可切割探针包含在所述环序列中的延伸阻断修饰。12.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二序列区的长度为6-20个核苷酸。13.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一序列区的长度为4-20个核苷酸。14.根据权利要求1所述的方法，其中与所述靶核酸第一链上的第一区互补的序列的长度为10-50个核苷酸。15.根据权利要求1所述的方法，其中所述可切割探针的所述一个或更多个核糖核苷酸碱基正好位于为所述第二序列区之反向互补序列的序列的3’。16.根据权利要求1所述的方法，其中所述可切割探针的所述一个或更多个核糖核苷酸碱基位于距离与所述靶核酸第一链上的第一区互补之序列的3’端至少4个碱基。17.根据权利要求1所述的方法，其中所述可切割探针包含这样的序列，所述序列包含与所述靶核酸序列第一链上的第一区互补的1至5个核糖核苷酸碱基。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述可切割探针包含这样的序列，所述序列包含与所述靶核酸序列第一链上的第一区互补的3至5个核糖核苷酸碱基。19.根据权利要求1所述的方法，其中用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的所述至少一个非天然核苷酸位于所述可切割探针的5’端。20.根据权利要求1所述的方法，其中所述可切割探针包含在3’端的延伸阻断修饰。21.根据权利要求1所述的方法，其中所述可切割探针的所述第二序列区包含至少50％的G/C含量。22.根据权利要求1所述的方法，其中所述可切割探针的所述第二序列区的长度为6-15个核苷酸。23.根据权利要求1所述的方法，其中所述可切割探针的所述第二序列区包含一个或更多个非天然碱基。24.根据权利要求1所述的方法，其中在内切核糖核酸酶切割后，所述截短的可切割探针与所述靶核酸的解链点低于所述可切割探针与所述靶核酸的退火温度。25.根据权利要求1所述的方法，其中在内切核糖核酸酶切割后，所述截短的可切割探针与所述靶核酸的解链点低于55℃。26.根据权利要求1所述的方法，其中报告基团-淬灭基团对的所述第一成员是报告基团。27.根据权利要求26所述的方法，其中所述报告基团是荧光团。28.根据权利要求27所述的方法，其中所述信号改变是荧光信号降低。29.根据权利要求1所述的方法，其中检测所述标记物的信号改变包括随着所述样品的温度改变检测报告基团的信号改变。30.根据权利要求29所述的方法，其中检测所述报告基团的信号改变包括当所述样品的温度升高到高于所述发夹探针的解链点时检测所述报告基团的信号改变。31.根据权利要求1所述的方法，其中所述可切割探针连接至固体支持物。32.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一个非天然核苷酸或所述淬灭基团标记的非天然核苷酸是isoG，并且另一个是isoC。33.根据权利要求1所述的方法，其还包括：(a)使所述样品与第二可切割探针接触，所述探针从5’至3’包含(i)包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸的第一序列区；(ii)第二序列区；(iii)为所述第二序列区的反向互补序列的序列；和(iv)包含与第二靶核酸第一链上的第一区互补的一个或更多个核糖核苷酸碱基的序列；(b)使所述可切割探针与内切核糖核酸酶接触，从而切割与靶核酸杂交的探针以形成截短的可切割探针；(c)使所述截短的可切割探针与其自身杂交以形成发夹探针；(d)在能够与所述第一序列区的所述至少一个非天然核苷酸碱基配对的用报告基团-淬灭基团对的第二成员标记的非天然核苷酸的存在下延伸所述发夹探针；以及(e)通过检测所述可切割探针和所述发夹探针上标记物的信号改变来检测所述第二靶核酸。34.根据权利要求33所述的方法，其还包括：(a)使所述样品与第三、第四、第五或第六可切割探针接触，所述探针从5’至3’包含：(i)包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸的第一序列区；(ii)第二序列区；(iii)为所述第二序列区的反向互补序列的序列；和(iv)包含与第三、第四、第五或第六靶核酸第一链上的第一区互补的一个或更多个核糖核苷酸碱基的序列；(b)使所述可切割探针与内切核糖核酸酶接触，从而切割与靶核酸杂交的探针以形成截短的可切割探针；(c)使所述截短的可切割探针与其自身杂交以形成发夹探针；(d)在能够与所述第一序列区的所述至少一个非天然核苷酸碱基配对的用报告基团-淬灭基团对的第二成员标记的非天然核苷酸的存在下延伸所述发夹探针；以及(e)通过检测所述可切割探针和所述发夹探针上标记物的信号改变来检测所述第三、第四、第五或第六靶核酸。35.根据权利要求33所述的方法，其中基本上同时检测所述第一靶核酸和所述第二靶核酸的存在。36.根据权利要求33所述的方法，其中依次检测所述第一靶核酸和所述第二靶核酸的存在。37.根据权利要求33所述的方法，其中所述第一探针和所述第二探针包含可区分的报告基团。38.根据权利要求33所述的方法，其中所述第一探针和所述第二探针包含相同的报告基团。39.根据权利要求38所述的方法，其中由所述第一探针和所述第二探针形成的发夹探针包含可区分的解链点。40.根据权利要求34所述的方法，其中由所述第一、第二、第三、第四、第五和第六探针形成的发夹探针各自包含可区分的标记物或可区分的解链点。41.根据权利要求34所述的方法，其中所述第一、第二、第三、第四、第五和第六可切割探针各自包含相同的第一序列区、第二序列区和/或在所述第二序列区和为所述第二序列区的反向互补序列的序列之间的相同环序列。42.根据权利要求1所述的方法，其还包括使用等温扩增来扩增所述靶核酸。43.根据权利要求1所述的方法，其还包括使用所述可切割探针以等温放大所述信号。44.根据权利要求1所述的方法，其还包括进行多个聚合酶链式反应循环。45.根据权利要求44所述的方法，其中检测所述标记物的信号改变包括在进行所述多个聚合酶链式反应循环之前和之后检测信号。46.根据权利要求44所述的方法，其中检测所述标记物的信号改变包括仅在进行所述多个聚合酶链式反应循环之后检测信号。47.根据权利要求46所述的方法，其还包括将所检测到的标记物之信号与预定比相比较，所述预定比为所述标记物的信号与非杂交探针上标记物之参照信号的比。48.根据权利要求44所述的方法，其还包括对样品中靶核酸的量进行定量。49.根据权利要求48所述的方法，其中对所述样品中靶核酸的量进行定量包括：使用标准曲线；确定所述靶核酸的相对量；使用终点定量；或通过将所述信号相对于背景可检测时的PCR循环数与存在的靶标量相关联来确定所述靶核酸的量。50.组合物，其包含第一可切割探针，所述探针从5’至3’包含：(i)包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸的第一序列区；(ii)第二序列区；(iii)为所述第二序列区的反向互补序列的序列；和(iv)包含与靶核酸第一链上的第一区互补的一个或更多个核糖核苷酸碱基的序列。51.根据权利要求50所述的组合物，其还包含第二可切割探针，所述探针从5’至3’包含：(i)包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸的第一序列区；(ii)第二序列区；(iii)为所述第二序列区的反向互补序列的序列；和(iv)包含与第二靶核酸第一链上的第一区互补的一个或更多个核糖核苷酸碱基的序列。52.根据权利要求51所述的组合物，其中所述第一探针和所述第二探针包含可区分的报告基团，或形成具有可区分解链点的发夹探针。53.根据权利要求51所述的组合物，其包含至少四种探针。54.根据权利要求50所述的组合物，其还包含报告基团标记的或淬灭基团标记的非天然核苷酸。55.根据权利要求50所述的组合物，其还包含聚合酶、内切核糖核酸酶、参照探针或游离核苷酸。56.试剂盒，其包含：(a)第一可切割探针，所述探针从5’至3’包含(i)包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸的第一序列区；(ii)第二序列区；(iii)为所述第二序列区的反向互补序列的序列；和(iv)包含与靶核酸第一链上的第一区互补的一个或更多个核糖核苷酸碱基的序列；以及(b)报告基团标记的非天然核苷酸；淬灭基团标记的非天然核苷酸；或内切核糖核酸酶。57.根据权利要求56所述的试剂盒，其包含至少四种探针。58.根据权利要求57所述的试剂盒，其中所述探针包含可区分的报告基团和/或形成具有可区分解链点的发夹探针。59.根据权利要求56所述的试剂盒，其还包含聚合酶、参照探针、游离核苷酸、参照样品或所述试剂盒的使用说明书。60.用于检测靶核酸存在的方法，其包括：(a)使样品与第一探针组接触，所述探针组包含可切割探针和捕获探针，所述可切割探针从5’至3’包含(i)包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸的序列区；(ii)捕获序列；和(iii)包含与所述靶核酸第一链上的第一区互补的一个或更多个核糖核苷酸碱基的序列；所述捕获探针从5’至3’包含(i)与所述可切割探针的所述序列区相同的序列区，其包含与所述可切割探针的所述至少一个非天然核苷酸相同的至少一个未标记的非天然核苷酸；和(ii)与所述可切割探针的捕获序列互补的序列；(b)使所述可切割探针与内切核糖核酸酶接触，从而切割与靶核酸杂交的探针以形成截短的可切割探针；(c)使所述截短的可切割探针与所述捕获探针杂交；(d)在能够与所述捕获探针中的所述至少一个未标记的非天然核苷酸碱基配对的用报告基团-淬灭基团对的第二成员标记的非天然核苷酸的存在下延伸所述截短的可切割探针以形成延伸的可切割探针；以及(e)使所述延伸的可切割探针与其自身杂交以形成发夹探针；(f)通过检测所述可切割探针和所述发夹探针上标记物的信号改变来检测所述靶核酸。61.根据权利要求60所述的方法，其中所述可切割探针包含这样的序列，所述序列包含与所述靶核酸序列第一链上的第一区互补的1至5个核糖核苷酸碱基。62.根据权利要求60所述的方法，其中所述内切核糖核酸酶是RNA酶H。63.根据权利要求62所述的方法，其中所述RNA酶H是RNA酶HII。64.根据权利要求60所述的方法，其中所述内切核糖核酸酶是热稳定的RNA酶HII。65.根据权利要求60所述的方法，其中所述内切核糖核酸酶是嗜热的、热启动的RNA酶HII。66.根据权利要求61所述的方法，其中所述可切割探针包含这样的序列，所述序列包含与所述靶核酸序列第一链上的第一区互补的3至5个核糖核苷酸碱基。67.根据权利要求60所述的方法，其中所述可切割探针上的所述捕获序列包含一个或更多个非天然碱基。68.根据权利要求60所述的方法，其中在所述内切核糖核酸酶切割之前，所述可切割探针和所述捕获探针的解链点低于55℃。69.根据权利要求60所述的方法，其中所述可切割探针包含在3’端的延伸阻断修饰。70.根据权利要求60所述的方法，其中所述可切割探针包含位于核糖核苷酸碱基3’的延伸阻断修饰。71.根据权利要求60所述的方法，其中所述报告基团-淬灭基团对的第一成员是报告基团。72.根据权利要求71所述的方法，其中所述报告基团是荧光团。73.根据权利要求72所述的方法，其中所述信号改变是荧光信号降低。74.根据权利要求60所述的方法，其中检测所述标记物的信号改变包括随着所述样品的温度改变检测报告基团的信号改变。75.根据权利要求74所述的方法，其中检测所述报告基团的信号改变包括当所述样品的温度升高到高于发夹探针的解链点时检测所述报告基团的信号改变。76.根据权利要求60所述的方法，其中所述捕获探针连接至固体支持物。77.根据权利要求60所述的方法，其中所述至少一个非天然核苷酸或所述淬灭基团标记的非天然核苷酸是isoG，并且另一个是isoC。78.根据权利要求60所述的方法，其还包括：(a)使所述样品与第二探针组接触，所述探针组包含可切割探针和捕获探针，所述可切割探针从5’至3’包含(i)包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸的序列区；(ii)捕获序列；和(iii)包含与第二靶核酸第一链上的第一区互补的一个或更多个核糖核苷酸碱基的序列；所述捕获探针从5’至3’包含(i)与所述可切割探针的所述序列区相同的序列区，其包含与所述可切割探针的所述至少一个非天然核苷酸相同的至少一个未标记的非天然核苷酸；和(ii)与所述可切割探针的捕获序列互补的序列；(b)使所述可切割探针与内切核糖核酸酶接触，从而切割与所述第二靶核酸杂交的探针以形成截短的可切割探针；(c)使所述截短的可切割探针与所述捕获探针杂交；(d)在能够与所述捕获探针中的所述至少一个未标记的非天然核苷酸碱基配对的淬灭基团标记的非天然核苷酸的存在下延伸所述截短的可切割探针以形成延伸的可切割探针；以及(e)使所述延伸的可切割探针与其自身杂交以形成发夹探针；(f)通过检测所述可切割探针和所述发夹探针上标记物的信号改变来检测所述第二靶核酸。79.根据权利要求78所述的方法，其还包括：(a)使所述样品与第三、第四、第五或第六探针组接触，所述探针组包含可切割探针和捕获探针，所述可切割探针从5’至3’包含(i)包含用报告基团-淬灭基团对的第一成员标记的至少一个非天然核苷酸的序列区；(ii)捕获序列；和(iii)包含与第三、第四、第五或第六靶核酸第一链上的第一区互补的一个或更多个核糖核苷酸碱基的序列；所述捕获探针从5’至3’包含(i)与所述可切割探针的所述序列区相同的序列区，其包含与所述可切割探针的所述至少一个非天然核苷酸相同的至少一个未标记的非天然核苷酸；和(ii)与所述可切割探针的捕获序列互补的序列；(b)使所述可切割探针与内切核糖核酸酶接触，从而切割与所述第三、第四、第五或第六靶核酸杂交的探针以形成截短的可切割探针；(c)使所述截短的可切割探针与所述捕获探针杂交；(d)在能够与所述捕获探针中的所述至少一个未标记的非天然核苷酸碱基配对的淬灭基团标记的非天然核苷酸的存在下延伸所述截短的可切割探针以形成延伸的可切割探针；以及(e)使所述延伸的可切割探针与其自身杂交以形成发夹探针；(f)通过检测所述可切割探针和所述发夹探针上标记物的信号改变来检测所述第三、第四、第五或第六靶核酸。80.根据权利要求78所述的方法，其中基本上同时检测所述第一靶核酸和所述第二靶核酸的存在。81.根据权利要求78所述的方法，其中依次检测所述第一靶核酸和所述第二靶核酸的存在。82.根据权利要求78所述的方法，其中所述第一探针组和所述第二探针组包含可区分的报告基团。83.根据权利要求78所述的方法，其中所述第一探针组和所述第二探针组包含相同的报告基团。84.根据权利要求83所述的方法，其中由所述第一探针组和所述第二探针组形成的发夹探针具有可区分的解链点。85.根据权利要求79所述的方法，其中由所述第一、第二、第三、第四、第五和第六探针组形成的发夹探针各自包含可区分的报告基团或可区分的解链点。86.根据权利要求60所述的方法，其还包括使用等温扩增来扩增所述靶核...

【专利技术属性】
技术研发人员：斯科特·C·约翰逊，尼古拉斯·阿拉贝，道格·惠特曼，
申请(专利权)人：卢米耐克斯公司，
类型：发明
国别省市：美国,US